In zijn presentatie "Hoe CRISPR-Cas te gebruiken om AMR te bestrijden" op het ESCMID Global Congress zal assistent-professor Ibrahim Bitar, afdeling Microbiologie, Faculteit Geneeskunde en Universitair Ziekenhuis in Plzen, Charles Universiteit in Praag, Plzen, Tsjechië, een overzicht geven van de moleculaire biologie van CRISPR-technologie en uitleggen hoe deze kan worden gebruikt om antimicrobiële resistentie aan te pakken.

Geclusterde korte palindromische herhalingen (CRISPR's) en CRISPR-geassocieerde genen (cas) zijn wijdverspreid in het genoom van veel bacteriën en vormen een verdedigingsmechanisme tegen vreemde indringers zoals plasmiden en virussen. De CRISPR-arrays zijn samengesteld uit een herhaalde reeks korte sequenties, elk afkomstig van en exact overeenkomend met een nucleïnezuursequentie die ooit de gastheer is binnengedrongen.

Bij de CRISPR-sequenties zijn er 4-10 CRISPR-geassocieerde genen (cas), die sterk geconserveerd zijn en coderen voor de Cas-eiwitten. Cas-eiwitten voeren adaptieve immuniteit uit in prokaryoten (bacteriën) op basis van immunologische herinneringen die zijn opgeslagen in de CRISPR-array.

Het CRISPR/Cas-systeem integreert een klein stukje vreemd DNA van indringers zoals plasmiden en virussen in hun directe herhalingssequenties en zal dezelfde externe DNA-elementen herkennen en afbreken tijdens toekomstige invasies.

Omdat de CRISPR/Cas-systemen DNA van binnendringende pathogenen in chronische volgorde integreren, kan genotypering worden gebruikt om de klonaliteit en de oorsprong van de isolaten te traceren en ze te definiëren als een populatie van stammen die werden onderworpen aan dezelfde omgevingsomstandigheden, inclusief geografische locatie (regio ) en gemeenschaps-/ziekenhuisomgevingen en uiteindelijk verder uitgebreid om pathogene bacteriën in de menselijke samenleving op te sporen.

CRISPR/Cas-systemen kunnen ook worden gebruikt voor de ontwikkeling van antimicrobiële middelen:de introductie van zelfgerichte crRNA's zal doelbacteriepopulaties effectief en selectief doden. Vanwege het tekort aan beschikbare effectieve antimicrobiële middelen bij de behandeling van multiresistente (MDR) infecties, zijn onderzoekers op zoek gegaan naar alternatieve methoden om MDR-infecties te bestrijden in plaats van het proces van het ontwikkelen van nieuwe antimicrobiële middelen te doorlopen, dat tientallen jaren kan duren. P>

Als gevolg hiervan werd het concept van op CRISPR/Cas gebaseerde selectieve antimicrobiële stoffen voor het eerst ontwikkeld en gedemonstreerd in 2014. Vectoren die Cas9 coderen en gids-RNA's die zich richten op genomische loci van een specifieke bacteriestam/soort kunnen via bacteriofagen of conjugatieve bacteriële stammen aan de doelstam worden afgeleverd. stammen.

In theorie elimineert de levering van de ontwikkelde CRISPR/Cas-systemen specifiek doelstammen uit de bacteriepopulatie, maar zo eenvoudig is het niet.

Hoewel deze systemen een doelwit kunnen lijken voor manipulatie/interventie, worden alle bacteriën via meerdere routes gereguleerd om ervoor te zorgen dat de bacteriën de controle over het proces behouden. Daarom blijven er nog steeds verschillende grote uitdagingen bestaan ​​bij het gebruik van dit systeem als antimicrobieel middel.

Bij de meeste methoden is de levering van het opnieuw gesensibiliseerde systeem door conjugatie vereist; de vector wordt gedragen door een niet-virulente laboratoriumstambacterie waarvan wordt verwacht dat hij de vector/plasmide gaat delen door middel van conjugatie. Het conjugatieproces is een natuurlijk proces dat de bacteriën uitvoeren en dat resulteert in het delen van plasmiden met elkaar (zelfs met andere soorten).

Het percentage geconjugeerde (met succes afgeleverde) bacteriën in de totale bacteriepopulatie is van cruciaal belang voor de efficiëntie van het opnieuw gevoelig maken. Dit proces wordt beheerst door verschillende ingewikkelde trajecten.

Bacteriën beschikken ook over ingebouwde anti-CRISPR-systemen, die eventuele schade veroorzaakt door CRISPR-Cas-systemen kunnen herstellen.

Afweersystemen die de bacterie gebruikt om zichzelf te beschermen tegen vreemd DNA, zijn vaak co-lokalisatie binnen verdedigingseilanden (genomische segmenten die genen bevatten met een vergelijkbare functie bij het beschermen van de gastheer tegen indringers) in bacteriële genomen; bijvoorbeeld:acr (een gen dat, samen met andere vergelijkbare varianten, werkt als een repressor van plasmideconjugatieve systemen) clustert vaak met antagonisten van andere gastheerverdedigingsfuncties (bijvoorbeeld anti-restrictiemodificatiesystemen) en experts veronderstellen dat MGE's (mobiele genetische elementen ) organiseren hun tegenverdedigingsstrategieën op “anti-verdedigings”-eilanden.

Universitair docent Bitar concludeert:“Samenvattend lijkt deze methode zeer veelbelovend als een alternatieve manier om antimicrobiële resistentie te bestrijden. De methode maakt gebruik van het concept van het opnieuw gevoelig maken van de bacteriën om gebruik te maken van reeds beschikbare antibiotica – met andere woorden, het verwijderen van hun antibiotica. resistentie en maakt ze weer kwetsbaar voor eerstelijnsantibiotica.

“Desalniettemin zijn de bacteriële routes altijd ingewikkeld en worden dergelijke systemen altijd sterk gereguleerd door meerdere routes. Deze gereguleerde routes moeten diepgaand worden bestudeerd om selectieve druk te vermijden die de activering van anti-CRISPR-systemen bevordert, en dus de prevalentie van resistentie op een agressievere manier. ."

Aangeboden door de European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases