Celbiologen gebruiken traditioneel fluorescerende kleurstoffen om cellen en de moleculen erin onder een microscoop te labelen en te visualiseren. Met verschillende superresolutiemicroscopiemethoden, ze kunnen zelfs afzonderlijke moleculen en hun complexe interacties met elkaar verlichten. Echter, de microscopie-hardware waarmee ze dit kunnen doen, is zeer gespecialiseerd en duur en daarom relatief zeldzaam in laboratoria over de hele wereld, en de werking van dergelijke microscopen is ontmoedigend, omdat het unieke vaardigheden vereist.

Ralf Jungmann, doctoraat, een alumnus van het Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering van Harvard en momenteel professor aan de Ludwig Maximilian University (LMU) en het Max Planck Institute (MPI) of Biochemistry in Duitsland en Peng Yin, kernfaculteitslid van het Wyss Institute, doctoraat, hebben DNA-PAINT ontwikkeld, een krachtige moleculaire beeldvormingstechnologie die voorbijgaande DNA-DNA-interacties omvat om fluorescerende kleurstoffen nauwkeurig te lokaliseren met superresolutie. Echter, hoewel de onderzoekers het potentieel van DNA-PAINT hebben aangetoond door afzonderlijke biomoleculen te visualiseren, zoals eiwitten, in vaste cellen op een vaste korte afstand, de technologie kon nog niet worden toegepast om moleculen diep in cellen te onderzoeken.

Nutsvoorzieningen, De teams van Jungmann en Yin rapporteren gezamenlijk een oplossing om deze beperking te overwinnen. In hun nieuwe studie ze hebben de DNA-PAINT-technologie aangepast aan microscopen die wijdverbreid zijn in celbiologische laboratoria, confocale microscopen genoemd, en die door onderzoekers worden gebruikt om hele cellen en dikkere weefsels met een lagere resolutie in beeld te brengen. Het team van MPI/Wyss Institute toont aan dat de methode een verscheidenheid aan verschillende moleculen kan visualiseren, inclusief combinaties van verschillende eiwitten, RNA's en DNA door de hele diepte van hele cellen met superresolutie. Gepubliceerd in Natuurcommunicatie , de aanpak zou de deur kunnen openen voor gedetailleerde lokalisatiestudies van één molecuul op veel gebieden van celonderzoek.

De DNA-PAINT-benadering hecht een DNA "ankerstreng aan het molecuul van belang. Vervolgens hecht een met kleurstof gelabelde DNA "imagerstreng" met een complementaire sequentie tijdelijk aan het anker en produceert een fluorescerend signaal, die optreedt als een gedefinieerde knipperende gebeurtenis op enkele moleculaire plaatsen. Omdat "knipperen" precies af te stemmen is, moleculen die slechts nanometers van elkaar verwijderd zijn, kunnen worden onderscheiden - aan het hogere resolutie-einde van superresolutie.

"Onze nieuwe aanpak, SDC-VERF, integreert de veelzijdige superresolutiemogelijkheden van DNA-PAINT met de optische snijfuncties van confocale microscopen. Zo creëerden we de middelen om de hele diepte van een cel te onderzoeken, en om de moleculen erin te visualiseren op nanometerschaal, " zei Jungmann. Het team bracht de aanwezigheid van verschillende combinaties van eiwitten in hele cellen in kaart en ging verder dan dat. "Door onze etiketteringsbenaderingen te diversifiëren, we visualiseerden ook verschillende soorten individuele biomoleculen in de chromosoombevattende kern, inclusief sequenties in het DNA, eiwitten gebonden aan DNA of het membraan dat de kern omsluit, evenals nucleaire RNA's, " voegt Yin toe, die ook co-leider is van het Molecular Robotics Initiative van het Wyss Institute, en hoogleraar systeembiologie aan de Harvard Medical School. .

In principe, confocale microscopen gebruiken zogenaamde pinholes om ongewenste onscherpe fluorescentie van beeldvlakken boven en onder het brandvlak te elimineren. Door het monster te scannen, vliegtuig na vliegtuig, onderzoekers kunnen de fluorescentiesignalen die worden uitgezonden door molecuulgebonden kleurstoffen over de hele diepte verzamelen. specifiek, het team van het MPI/Wyss Institute ontwikkelde de techniek voor "Spinning Disk Confocal" (SDC)-microscopen die fluorescentiesignalen van een heel vlak in één keer detecteren door ze te detecteren door een roterende schijf met meerdere gaatjes. Bovendien, "om 3D-superresolutie te bereiken, we hebben een extra lens in het detectiepad geplaatst, waarmee we sub-diffractie-beperkte resolutie in de derde dimensie kunnen archiveren", aldus eerste auteur Florian Schueder, een afgestudeerde student die werkte met Jungmann die ook werkte met het Wyss Institute-team van Yin als onderdeel van zijn masterscriptie.

"Deze toevoeging kan eenvoudig worden aangepast door fabrikanten van SDC-microscopen; dus implementeren we in principe superresolutiemicroscopie zonder complexe hardwarewijzigingen in microscopen die algemeen beschikbaar zijn voor celbiologen van alle locaties van biomedisch onderzoek. De aanpak heeft dus het potentieel om super -resolutie beeldvorming door hele cellen en weefsels, ’ zei Jungmann.

"Met deze belangrijke vooruitgang, superresolutiemicroscopie en DNA-PAINT zouden toegankelijker kunnen worden voor biomedische onderzoekers, het versnellen van onze inzichten in de functie van individuele moleculen en de processen die ze in cellen aansturen, " zei Donald Ingber, oprichter van het Wyss Institute, MD, doctoraat, die ook de Judah Folkman Professor of Vascular Biology is aan de HMS en het Vascular Biology Program aan het Boston Children's Hospital, evenals hoogleraar bio-engineering aan SEAS.