Toen senior wetenschapper Jonathan Grimm dertien jaar geleden bij Janelia kwam, wist hij niet veel over fluorescentie of fluorescerende kleurstoffen. Maar als organisch chemicus die bij Merck had gewerkt aan de ontdekking van geneesmiddelen, wist hij zeker het een en ander over medicinale chemie.

In een opwelling besloten Grimm en Janelia Senior Group Leader Luke Lavis om te proberen een belangrijke geneeskrachtige chemische reactie te gebruiken die Grimm in de farmaceutische industrie had opgepikt om de eeuwenoude kleurstofchemie te verbeteren. Ze dachten dat deze aanpak toegang zou kunnen bieden tot compleet nieuwe, voorheen ontoegankelijke rhodamines:moleculen waar Lavis aan werkte om ze helderder te maken en langer mee te gaan, zodat ze gebruikt konden worden om cellen beter in beeld te brengen onder krachtige microscopen.

Het resultaat was het begin van wat de nu alomtegenwoordige en onmisbare Janelia Fluor-kleurstoffen zouden worden:heldere, fotostabiele, celdoorlaatbare fluorescerende sondes waarmee biologen de moleculen in cellen kunnen zien. Meer dan tien jaar nadat ze voor het eerst werden onthuld, zijn deze fluorescerende kleurstoffen die het kleurenspectrum bestrijken, uitgegroeid tot een belangrijk onderdeel van biologielaboratoria over de hele wereld.

Met een vergelijkbare aanpak hebben Grimm, Lavis en hun medewerkers nu het resultaat van hun jarenlange werk gepubliceerd in het Journal of the American Chemical Society :een uitgebreide verzameling aanvullende op rhodamine gebaseerde fluorescerende kleurstoffen - een geheel nieuwe reeks verrood verschoven kleurstoffen die dieper in het weefsel kunnen doordringen en goed zijn voor in vivo beeldvorming, waardoor ze van vitaal belang zijn voor biologen.

Het team deelde ook hun aanpak:de nieuwe chemie die ze ontwikkelden om de kleurstoffen en inzichten te synthetiseren die een routekaart bieden voor het ontwerpen van toekomstige sondes.

"Gaandeweg hebben we totaal nieuwe manieren toegepast of aangepast of bedacht om rhodamines te maken die een vrij brede reikwijdte hebben, en dat stelde ons in staat relatief snel zoveel kleurstoffen te maken", zegt Grimm. "Dit is waarschijnlijk het meest uitgebreide werk dat we tot nu toe met rhodamines hebben gedaan."

Een uitgebreide collectie maken

Het nieuwste project ging van start bij het uitbreken van de COVID-19-pandemie begin 2020. Het team had zojuist onderzoek gepubliceerd waarin de nieuwe chemie werd beschreven die ze gebruikten om het Janelia Fluor-kleurpalet uit te breiden.

Vervolgens wilden ze kijken of ze wat ze hadden geleerd over het optimaliseren van de Janelia Fluor-kleurstoffen konden toepassen op andere soorten op rhodamine gebaseerde kleurstoffen en tegelijkertijd de chemie die werd gebruikt om ze te synthetiseren verder te verbeteren.

Toen de wereld stilviel, planden Grimm en Lavis nieuwe chemie – inclusief geheel nieuwe chemische reacties – die probeerden de lessen die uit de Janelia Fluor-kleurstoffen waren geleerd op rationele wijze te integreren in andere klassieke maar suboptimale rhodamines.

Een paar maanden later keerde Grimm terug naar het laboratorium en begon te kijken of hun werk op papier zich kon vertalen naar de echte – en soms onvoorspelbare – wereld van de organische chemie. Nu de COVID-voorzorgsmaatregelen waren getroffen, werkte Grimm alleen in het laboratorium, optimaliseerde de chemie en creëerde de eerste nieuwe kleurstoffen.

"Het zou waarschijnlijk hoe dan ook zijn gebeurd, maar ten goede of ten kwade, als er niets anders is om op te concentreren, of als de dingen waarop je je moet concentreren slecht zijn (zoals 2020 voor iedereen was), was scheikunde een leuke afleiding", zegt Grimm.

Het nieuwe onderzoek vormt het hoogtepunt van het werk van het team van de afgelopen ruim drie jaar. In tegenstelling tot de traditionele Janelia Fluor-kleurstoffen, die worden gekenmerkt door een aanhangsel dat een azetidine-ring wordt genoemd, hebben de andere op rhodamine gebaseerde kleurstoffen verschillende substituenten die uit andere delen van hun moleculaire structuren steken.

Gewapend met kennis uit het optimaliseren van de JF-kleurstoffen, heeft het team deze andere gebieden van de oudere rhodaminekleurstoffen aangepast om hun kleur, helderheid, fotostabiliteit, celpermeabiliteit en andere kenmerken te veranderen.

Het resultaat is een geheel nieuwe reeks op rhodamine gebaseerde kleurstoffen voor beeldvorming. Het team kon ook verschillende nieuwe manieren bedenken om klassieke rhodaminekleurstoffen te maken, waardoor ze relatief snel tientallen functionele versies konden maken.

"We wisten al lang hoe het veranderen van de functionaliteit aan de 'bovenkant' van het molecuul de kleuren van de fluoroforen beïnvloedt, maar we kwamen er ook achter dat dit de chemische eigenschappen van de kleurstof sterk beïnvloedt", zegt Lavis. "We hebben dat op verschillende manieren benut om heldere, roodverschoven beeldvormende middelen te maken."

Het laatste hoofdstuk

Hoewel dit niet het einde is van het verhaal voor rhodaminekleurstoffen, gaat het werk waarschijnlijk een andere kant op. Nu concentreert het team zich op het ontwerpen van reagentia die specifiek zijn afgestemd op gebruik door hun biologen, en werken ze aan het bouwen van de allerbeste tools die ze kunnen met de kennis die ze hebben verworven.

"Met deze chemie kunnen we elke rhodaminekleurstof maken die we maar willen, en dus is de grote vraag wat we vervolgens gaan maken", zegt Lavis. "Het gaat er niet om wat we kunnen maken, maar wat we moeten maken."

Grimm zegt dat de ontwikkeling van deze uitgebreide reeks rhodaminen, die meer dan tien jaar heeft geduurd, een bewijs is van de steun van HHMI Janelia aan langetermijninspanningen die gunstig zijn voor de bredere wetenschappelijke gemeenschap. Dankzij de vaste wetenschappelijke posities bij Janelia kunnen Grimm en andere senior wetenschappers ook continuïteit bieden aan een groot project als de Janelia Fluor-kleurstoffen. Vier van de onderzoekers van de meest recente publicatie waren ook bezig met het allereerste rhodamine-kleurstofpapier dat het laboratorium in 2011 publiceerde.

Voor Grimm betekent het ook dat hij mag doen waar hij van houdt:in het laboratorium zijn, scheikunde doen en hulpmiddelen maken die nuttig zijn voor biologen. En ruim dertien jaar later heeft hij ook het een en ander geleerd over fluorescerende kleurstoffen.

"Het is zeer bevredigend om deze tijdlijn met papieren te hebben die alles laat zien wat we in de afgelopen jaren hebben gedaan, en het begon allemaal met slechts één willekeurige reactie, gebaseerd op een kleine berekening die Luke deed, die op zichzelf mogelijk werd gemaakt door een synthetische methode die we zijn er in een opwelling gewoon achteraan gegaan om de kleurstofsynthese wat makkelijker te maken", zegt Grimm. "Ook al ziet een berekening er goed uit, toch komt het niet altijd zo uit. In dit geval was het een schot in de roos, en het heeft zeker zijn vruchten afgeworpen."

Meer informatie: Jonathan B. Grimm et al., Geoptimaliseerde roodabsorberende kleurstoffen voor beeldvorming en detectie, Journal of the American Chemical Society (2023). DOI:10.1021/jacs.3c05273

Journaalinformatie: Journaal van de American Chemical Society

Aangeboden door Howard Hughes Medical Institute