Onderzoekers van het Braziliaanse Centrum voor Onderzoek naar Energie en Materialen (CNPEM) hebben een schimmel genetisch gemanipuleerd om een ​​cocktail van enzymen te produceren die de koolhydraten in biomassa afbreken. zoals suikerrietafval (toppen en bladeren) en bagasse, in vergistbare suiker voor industrieel efficiënte omzetting in biobrandstof.

De ontwikkeling van goedkope enzymcocktails is een van de grootste uitdagingen bij de productie van ethanol van de tweede generatie.

Biobrandstoffen van de tweede generatie worden vervaardigd uit verschillende soorten non-food biomassa, inclusief landbouwresten, houtsnippers en afgewerkte frituurolie. Het proces van de onderzoeksgroep CNPEM maakt de weg vrij voor een optimaal gebruik van suikerrietresiduen voor de productie van biobrandstoffen.

De schimmel Trichoderma reesei is een van de meest productieve producenten van enzymen die de celwand van planten afbreken en wordt veel gebruikt in de biotechnologische industrie. Om zijn productiviteit als biofabriek voor de enzymcocktail in kwestie te verhogen, introduceerden de onderzoekers zes genetische modificaties in RUT-C30, een openbaar beschikbare stam van de schimmel. Ze patenteerden het proces en rapporteerden het in een artikel dat in het tijdschrift werd gepubliceerd Biotechnologie voor biobrandstoffen .

"De schimmel werd rationeel gemodificeerd om de productie van deze enzymen van biotechnologisch belang te maximaliseren. Met behulp van de CRISPR/Cas9-genbewerkingstechniek, we hebben transcriptiefactoren aangepast om de expressie van genen geassocieerd met de enzymen te reguleren, verwijderde proteasen die problemen veroorzaakten met de stabiliteit van de enzymcocktail, en voegde belangrijke enzymen toe die de schimmel in de natuur mist. Als resultaat, we konden de schimmel een grote hoeveelheid enzymen laten produceren uit agro-industrieel afval, een goedkope en overvloedige grondstof in Brazilië, "Mario T. Murakami, Wetenschappelijk directeur van CNPEM's Biorenewables Laboratory (LNBR), vertelde Agência FAPESP.

Per oogst wordt in Brazilië zo'n 633 miljoen ton suikerriet verwerkt, jaarlijks 70 miljoen ton rietafval genereren (droge massa), volgens de National Food Supply Company (CONAB). Dit afval wordt onderbenut voor de productie van brandstof-ethanol.

Murakami benadrukte dat vrijwel alle enzymen die in Brazilië worden gebruikt om biomassa af te breken, worden geïmporteerd van een paar buitenlandse producenten die de technologie onder bedrijfsgeheim houden. In deze context, de geïmporteerde enzymcocktail kan tot 50% van de productiekosten van een biobrandstof vertegenwoordigen.

"Onder het traditionele paradigma, er waren tientallen jaren van studies nodig om een ​​concurrerend platform voor de productie van enzymcocktails te ontwikkelen, "zei hij. "Bovendien, de cocktails konden niet alleen worden verkregen door middel van synthetische biologietechnieken van openbaar beschikbare soorten, omdat de producenten verschillende methoden gebruikten om ze te ontwikkelen, zoals adaptieve evolutie, de schimmel blootstellen aan chemische reagentia, en het induceren van genomische mutaties om het meest interessante fenotype te selecteren. Nutsvoorzieningen, echter, dankzij geavanceerde tools voor het bewerken van genen, zoals CRISPR/Cas9, we zijn erin geslaagd om met een paar rationele aanpassingen in tweeënhalf jaar een concurrerend platform neer te zetten."

Het door de CNPEM-onderzoekers ontwikkelde bioproces produceerde 80 gram enzymen per liter, de hoogste experimenteel ondersteunde titer tot nu toe gerapporteerd voor T. reesei uit een goedkope grondstof op basis van suiker. Dit is meer dan het dubbele van de concentratie die eerder in de wetenschappelijke literatuur werd gemeld voor de schimmel (37 gram per liter).

"Een interessant aspect van dit onderzoek is dat het niet beperkt bleef tot het laboratorium, Murakami zei. "We hebben het bioproces getest in een semi-industriële productieomgeving, opschalen voor een proeffabriek om de economische haalbaarheid ervan te beoordelen."

Hoewel het platform was aangepast voor de productie van cellulose-ethanol uit suikerrietresiduen, hij voegde toe, het kan andere soorten biomassa afbreken, en geavanceerde suikers kunnen worden gebruikt om andere biorenewables te produceren, zoals kunststoffen en halffabricaten.

Nieuwe enzymklasse

Het proces was het praktische resultaat (in termen van industriële toepassing) van breed onderzoek van LNBR om enzymen te ontwikkelen die koolhydraten kunnen afbreken. In een andere studie ondersteund door FAPESP en gepubliceerd in Natuur Chemische Biologie , de onderzoekers onthulden zeven nieuwe enzymklassen die vooral aanwezig zijn in schimmels en bacteriën.

De nieuwe enzymen behoren tot de familie van glycosidehydrolase (GH). Volgens Murakami, deze enzymen hebben een aanzienlijk potentieel voor toepassingen, niet alleen op het gebied van biobrandstoffen, maar ook in de geneeskunde, voedselverwerking en textiel, bijvoorbeeld. De enzymen zullen nieuwe industriële processen inspireren door gebruik te maken van de verschillende manieren waarop de natuur polysachariden (koolhydraten bestaande uit veel eenvoudige suikers) afbreekt.

Deze enzymen breken bètaglucanen af, enkele van de meest voorkomende polysachariden in de celwanden van granen, bacteriën en schimmels, en een groot deel van 's werelds beschikbare biomassa, wat het potentiële gebruik van de enzymen in voedselconserveringsmiddelen en textiel aangeeft. In het geval van biobrandstoffen de belangrijkste eigenschap is hun vermogen om materiaal dat rijk is aan plantaardige vezels te verteren.

"We wilden de diversiteit van de natuur in afbrekende polysachariden bestuderen en hoe deze kennis kan worden toegepast op processen in verschillende industrieën, Murakami zei. "Naast de ontdekking van nieuwe enzymen, een ander belangrijk aspect van dit onderzoek is de gelijkenis-netwerkbenadering die we gebruiken om systematische en diepgaande kennis van deze enzymfamilie te produceren. De aanpak stelde ons in staat om vanaf nul te beginnen en in relatief korte tijd, komen tot de meest bestudeerde familie van enzymen die actief zijn op bèta-1, 3-glucanen tot nu toe, met informatie beschikbaar over specificiteit en actiemechanismen."

Het belangrijkste criterium voor het classificeren van enzymen is meestal fylogenie, d.w.z., de evolutionaire geschiedenis van het molecuul, terwijl CNPEM-onderzoekers zich richten op functionaliteit.

"Dankzij de vooruitgang in de technologie voor DNA-sequencing, we hebben nu veel bekende genetische sequenties en een gevestigde capaciteit om moleculen en enzymen te bestuderen en te karakteriseren in termen van hun functionaliteit. Als resultaat, we hebben de methodologie voor het netwerk van gelijkenissen kunnen verfijnen en voor het eerst gebruiken om enzymen te bestuderen die actief zijn op polysachariden, ' zei Murakami.

Door gebruik te maken van de similariteitsnetwerkbenadering, de groep classificeerde zeven subfamilies van de enzymen op basis van functionaliteit. Kenmerkend voor ten minste één lid van elke onderfamilie, de onderzoekers kregen systematisch toegang tot de diversiteit van moleculaire strategieën voor het afbreken van bèta-glucanen in duizenden leden van de enzymfamilie.

Biochemisch hoogstandje

Fylogenetische analyse richt zich op DNA-regio's die in de loop van de tijd zijn geconserveerd, terwijl classificatie op functionaliteit is gebaseerd op niet-geconserveerde regio's die verband houden met functionele differentiatie. "Dit gaf ons efficiëntie en stelde ons in staat om meer dan 1 000 reeksen in slechts zeven subgroepen of klassen met dezelfde functie, ' zei Murakami.

Omdat de aanpak nieuw was, de onderzoekers voerden verschillende andere onderzoeken uit om de classificatiemethode te controleren en te valideren. Van de zeven groepen enzymen die polysachariden kunnen afbreken, ze verkregen 24 geheel nieuwe structuren, waaronder verschillende substraat-enzymcomplexen, beschouwd als cruciaal bij het verstrekken van informatie om de betrokken actiemechanismen te helpen begrijpen.

Het onderzoek omvatte functionele en structurele analyses om te begrijpen hoe deze enzymen inwerken op de betreffende koolhydraten. "Polysachariden zijn er in tientallen configuraties en zijn in staat tot vele soorten chemische bindingen, "Zei Murakami. "We wilden precies zien welke chemische bindingen en architecturen door elk enzym worden herkend. Om deze reden, het moest een multidisciplinair onderzoek zijn, het combineren van structurele en functionele gegevens ondersteund door analyse met behulp van massaspectrometrie, spectroscopie, mutagenese en diffractie-experimenten om de atomaire structuur op te helderen."

In het gedeelte "Nieuws en weergaven" van hetzelfde nummer van Natuur Chemische Biologie , Professor Paul Walton, Leerstoel Bioinorganische Chemie aan de Universiteit van York in het Verenigd Koninkrijk, beoordeelde de glycoside hydrolase-studie als een "biochemisch 'tour de force'" voor zijn innovatieve aanpak en prees zijn "enorme inzichten", eraan toevoegend dat de onderzoekers "exemplaren van elke klasse [enzymen] tot expressie konden brengen en isoleren om te onderzoeken of de verschillen in sequenties tussen de klassen werden weerspiegeld in hun structuren en activiteiten".