Eiwitten zijn de werkpaarden van de cel. Hun activiteit wordt vaak gecontroleerd door het toevoegen of verwijderen van chemicaliën die fosfaten worden genoemd, zoals het in- of uitschakelen van een elektrische stroom. Meten hoeveel eiwitten gefosforyleerd zijn, of ingeschakeld, een wegversperring voor onderzoek geweest. Omdat gefosforyleerde eiwitten moeilijk in grote hoeveelheden te krijgen zijn, ze kunnen moeilijk te analyseren zijn, zelfs met behulp van geavanceerde instrumenten zoals een massaspectrometer.

Pacific Northwest National Laboratory-onderzoekers hebben een manier bedacht om kleine hoeveelheden gefosforyleerde eiwitten te meten en te onderscheiden, een benadering die in onderzoek zou kunnen worden gebruikt om ziekten zoals diabetes en kanker te helpen behandelen. De studie verschijnt als het omslagartikel van 7 mei van het tijdschrift Analytische scheikunde .

Gefosforyleerde eiwitten onderscheiden

In een massaspectrometer, moleculen verzamelen zich in een val net voor het meetapparaat, zoals voertuigen die wachten op een oprit met een snelweg, zei co-auteur Karin D. Rodland, een PNNL laboratorium fellow en biomedisch onderzoeker. De val wordt vrijgegeven zodra deze voldoende moleculen heeft verzameld. Hierdoor kunnen de moleculen naar voren bewegen zoals de voertuigen wanneer het oprijlicht groen wordt.

Maar als er lage niveaus van gefosforyleerde eiwitten in een monster zitten, hun signaal is vaak te zwak voor een massaspectrometer om te detecteren, zodat de moleculen vast komen te zitten nog voordat ze worden gemeten.

In dit onderzoek, onderzoekers probeerden signalen te versterken om de barrière te omzeilen en zelfs de lage niveaus van eiwitten meetbaar te maken. Om dit te kunnen doen, het team gebruikte een bestaande techniek genaamd isobare labeling, die monsters chemisch labelt. Elke tag is uniek en hecht aan en identificeert alle eiwitten binnen een bepaald monster. Belangrijker, zodra de individueel gelabelde monsters zijn gemengd, ze worden een single, chemisch identiek monster.

"In de ogen van de massaspecificatie, " zei de corresponderende auteur Tao Liu, een biomedische wetenschapper bij PNNL, "het monster verschijnt als één identiteit."

slim, onderzoekers hebben isobaar een "versterkend" materiaal gelabeld en gemengd met de studiemonsters die beperkt waren in hoeveelheid, bij een boosting/monster-verhouding van 30 tot 1. Dit boostermateriaal is biologisch vergelijkbaar met de onderzoeksmonsters, zodat de eiwitcatalogi vergelijkbaar zijn en gemakkelijk verkrijgbaar zijn in een veel grotere hoeveelheid. Bijvoorbeeld, gemengde cellijnen kunnen worden gebruikt om weefsels na te bootsen.

Door het versterkende materiaal en de onderzoeksmonsters te combineren, was het totale signaal groot genoeg om te worden gedetecteerd door de massaspecificatie. Dit zorgde ervoor dat het instrument - dat geen metingen kan doen als het monster te klein is - in feite het hele monster groen verlichtte voor analyse.

De technologie lijkt veel op auto's en vrachtwagens die zichzelf sorteren op snelheid zodra ze invoegen op de snelweg, en dan de auto's uitkiezen op hun kleuren, zei Rodland. Die voertuigen zouden nooit zijn gesorteerd als ze het "go" -signaal van het meetapparaat niet hadden gekregen.

Toen de massaspecificatie het isobaar gelabelde en gemengde monster uit elkaar haalde voor analyse, de verhoudingen waarin de tags verschenen, lieten de wetenschappers toe om te bepalen hoeveel van elk peptide in elk origineel monster zat.

Stappen voorwaarts in ziektedetectie

Met behulp van de isobare labeling/stimuleringsstrategie, het team toonde eerst aan dat drie verschillende cellijnen van acute myeloïde leukemie - een type kanker dat begint in het beenmerg - effectief kunnen worden onderscheiden op basis van hun eiwitactiviteitsprofielen, met een relatief klein aantal cellen.

Onderzoekers richtten hun aandacht vervolgens op pancreaseilandjes, die een centrale rol spelen bij diabetes. Deze celclusters produceren hormonen - insuline en glucagon - die samenwerken om te voorkomen dat de bloedglucosewaarden te hoog of te laag worden. De cellen zijn doelwitten bij patiënten met type 1, of insuline-afhankelijk, suikerziekte. Echter, de eiwitactiviteit in menselijke eilandjes is moeilijk te bestuderen vanwege hun beperkte eiwitgehalte. Door gebruik te maken van de nieuwe techniek, onderzoekers analyseerden veranderingen in eiwitactiviteit in menselijke eilandjes als reactie op behandeling - een lang gezocht streven voor artsen die hun patiënten controleren.

"Dit zal ons nieuw inzicht geven in wat er gebeurt als insulineproducerende cellen sterven bij patiënten met diabetes, " zei Wei-Jun Qian, de andere corresponderende auteur van het artikel en een biomedische wetenschapper bij PNNL. "Het vermogen om eiwitactiviteit rigoureuzer te volgen, zal ons helpen begrijpen welke signaalroutes betrokken zijn bij celdood."

Op de horizon

De nieuwe aanpak is veelbelovend voor verschillende soorten biologisch en biomedisch onderzoek wanneer monstermateriaal schaars is. Toepassingen kunnen zijn het vergelijken van cellen voor en na medicamenteuze behandeling, verschillende doses testen, of het bestuderen van de timing van eiwitactivering of -deactivering.

"De mogelijkheden zijn eindeloos, " zei Liu. "Je kunt kwantificering op zeer grote schaal doen, en je kunt ook veel verschillende omstandigheden die je wilt bestuderen in één experiment mengen."