Onderzoekers hebben fluorescerende eiwitten ontwikkeld die kunnen worden gecontroleerd door oranje en groen licht. Deze eiwitten zullen helpen om processen in levende cellen te bestuderen. Resultaten zijn gepubliceerd in Natuurmethoden .

Fluorescerende eiwitten zenden intens zichtbaar licht uit met golflengten van 390 tot 700 nm. De natuurlijke functies van dergelijke eiwitten zijn divers; bijvoorbeeld, sommige soorten kwallen gebruiken groene fluorescerende vlekken om kleine organismen aan te trekken die als voedsel dienen. Optische eigenschappen van bepaalde fluorescerende eiwitten kunnen worden gecontroleerd met licht. Bijvoorbeeld, dergelijke eiwitten kunnen worden geactiveerd en gedeactiveerd, en worden daarom schakelbaar genoemd. Schakelbare fluorescerende eiwitten worden veel gebruikt in een nieuwe groep methoden die superresolutie-fluorescentiemicroscopie (nanoscopie) wordt genoemd. die beeldvorming van uiterst gedetailleerde intracellulaire structuren mogelijk maakt. Momenteel, wetenschappers gebruiken meestal blauwe of violette bestraling voor dergelijke microscopie, wat zeer giftig is voor cellen omdat het hun normale fysiologie verstoort en zelfs de dood kan veroorzaken.

"We waren de eersten die fotoschakelbare fluorescerende eiwitten maakten met optische eigenschappen die kunnen worden gecontroleerd met behulp van groen en oranje licht in plaats van blauw-violette straling. Het voordeel hiervan is minimale schade aan cellen. We gebruikten nieuwe eiwitten om cytoskeletveranderingen in levende cellen te observeren overuren, " legde Aleksandr Mishin uit, doctoraat, senior onderzoeker van het Shemyakin-Ovchinnikov Instituut voor Bioorganische Chemie van de Russische Academie van Wetenschappen, die het RSF-project leidde.

Om dergelijke fluorescerende eiwitten te maken, de wetenschappers veranderden ze door gerichte en willekeurige mutagenese via polymerasekettingreactie. Vervolgens klonen de wetenschappers eiwitten en selecteerden ze de best presterende met behulp van een microscoop. De auteurs analyseerden de resultaten van experimenten van andere biologen en bepaalden hoe de micro-omgeving van de chromofoor (het aromatische aminozuurresidu dat verantwoordelijk is voor de lichtabsorptie in het eiwit) moet worden gewijzigd om het in staat te stellen foto-switching te maken.

Echter, het verwachte resultaat heeft bijwerkingen, inclusief verminderde helderheid van het eiwit. De onderzoekers gebruikten willekeurige mutagenese om extra mutaties te vinden, die de bijwerkingen van de methode compenseert terwijl de doelmutatie behouden blijft.

De eiwitten worden reportereiwitten genoemd, omdat ze fungeren als "spionnen" in cellen. Ze zitten vast aan andere eiwitten die dan in een levende cel kunnen worden opgespoord. De gedetailleerde informatie die daarbij wordt verkregen, kan worden gebruikt in basiswetenschappelijk of biomedisch onderzoek. Bijvoorbeeld, tumorcellen bij kankerpatiënten vertonen dramatische verstoringen van de celmobiliteit en dynamische structurele veranderingen in het cytoskelet, een karkas in het cytoplasma van een levende cel. In de tussentijd, het onderzoek van deze processen in levende cellen door nanoscopie is moeilijk vanwege de te intense bestraling van monsters, waardoor het noodzakelijk is om methoden te gebruiken die minder toxisch zijn voor het organisme.

De auteurs gebruikten hun ontwikkeling om RESOLFT superresolutiemicroscopie uit te voeren. De eiwitten hebben een belangrijk kenmerk:hun fotowisseling is zeer efficiënt, wat betekent dat fluorescentie in milliseconden kan worden in- en uitgeschakeld. Dit is niet geschikt voor alle microscopiemethoden. In sommige gevallen, de hoge snelheid zal alleen maar hinderlijk zijn. In RESOLFT, de aan-uit-cyclus wordt vele malen herhaald voor aangrenzende punten die worden gescand met laserstralen. Hoe beter de schakeltijd van een fluorescerende tag, hoe sneller het volledige beeld kan worden verkregen, omdat het wisselen van foto's op elk punt minder tijd kost.

"De fluorescerende eiwitten die we hebben gemaakt, zullen superresolutiemicroscopie mogelijk maken zonder de levende cel te schaden, wat mogelijkheden biedt voor het bestuderen van dynamische processen in de cel, ' concludeerde Aleksandr Mishin.