NUS-chemici hebben onlangs selectieve probes ontwikkeld voor cytosolische fosfolipase A2 (cPLA2) om enzymniveaus en activiteit te bepalen.

cPLA2 is een belangrijk enzym dat veel wordt gebruikt bij het reguleren van ontstekingsreacties in het lichaam. Het heeft veel belangstelling gekregen op medisch gebied, met toenemende banden van zijn betrokkenheid bij inflammatoire en neurologische ziekten zoals de ziekte van Alzheimer en multiple sclerose. Het vermogen om cPLA2 in biologische systemen in beeld te brengen en correct te identificeren, is belangrijk voor het begrijpen van de mechanistische routes die bij deze ziekten betrokken zijn. Een team onder leiding van Prof LAM Yulin van de afdeling Chemie, NUS heeft enkele fluorescerende verbindingen ontdekt die cPLA2 kunnen afbeelden. Deze omvatten een remmer (verbinding die de enzymactiviteit vermindert) en een substraat (verbinding waarop het enzym inwerkt) die fluorescentie vertonen.

Door de structuur van een bekende remmer van cPLA2 na te bootsen, arachidonyltrifluormethylketon (AACOCF3), de onderzoeksgroep heeft met succes een fluorescerende organische kleurstof (coumarine) bevestigd aan het koolstofketenuiteinde van AACOCF3. Hierdoor ontstond een fluorogene vorm van AACOCF3 die zijn natieve remmende activiteit tegen cPLA2 behield. Voorlopige studies uitgevoerd op de nieuw ontworpen verbinding toonden aan dat het in staat is om onderscheid te maken tussen cellen die verschillende niveaus van cPLA2 bevatten. gelijktijdig, deze nieuw ontwikkelde sonde was in staat om cPLA2 te remmen het verstrekken van een dubbele rol van beeldvorming en remming. Hierdoor kunnen biochemici het enzym direct op cellulair niveau detecteren terwijl ze een beoogde biologische respons bewerkstelligen.

Aangemoedigd door deze resultaten, de onderzoeksgroep breidde hun studies uit door een andere sonde te ontwikkelen om cPLA2-activiteit te meten. De conventionele bepaling van cPLA2-activiteit maakt gebruik van een radioactieve verbinding als substraat. Echter, het gebruik van dergelijke testen is zeer ongewenst vanwege de gevaren die radioactieve materialen omringen. Om dit probleem te omzeilen, verschillende calorimetrische en fluorogene testkits voor het meten van cPLA2-activiteit zijn nu in de handel verkrijgbaar. Echter, deze testen kunnen ook andere enzymen in de PLA2-familie detecteren en zijn niet alleen selectief voor cPLA2. Het zou handig zijn om een ​​alternatieve sonde te hebben, die specifiek gericht is op cPLA2.

Door een vergelijkbare aanpak te volgen, fluorogene coumarine en fluoresceïne (een andere fluorescerende organische kleurstof) groepen werden gehecht aan fosfatidylcholine (een substraat van cPLA2). Dit veroorzaakt een niet-stralende interne energieoverdracht tussen de ene kleurstof naar de andere wanneer het lichtgevoelige deel wordt bestraald op zijn excitatiegolflengte; een fenomeen dat bekend staat als Förster-resonantie-energieoverdracht (FRET). Deze nieuwe substraatprobe bleek zeer selectief te zijn voor cPLA2, zonder verlies van natieve activiteit en geschikt voor screeningstests voor remmers.

De groep onderzoekt momenteel de effecten van het hechten van fluorescerende chemische verbindingen van verschillende kleuren aan zowel de remmer- als substraatsondes om hun toepassingen te verbreden.