Wetenschap
Team ontwikkelt een efficiënt gastheer-vectorsysteem voor een modelarchaeon door op CRISPR gebaseerd gastheer-plasmide-conflict op te lossen
Een onderzoeksgroep heeft veelzijdige genetische hulpmiddelen ontwikkeld voor Saccharolobus islandicus REY15A, een van de weinige archaea-modellen voor archaea-biologie en CRISPR-biologisch onderzoek.
Dergelijke hulpmiddelen omvatten efficiënte genoombewerking, robuuste eiwitexpressiesystemen, interferentieplasmidetest, genuitschakeling en op CRISPR gebaseerde genbewerking. Niettemin zijn de plasmidevectoren die tot nu toe voor dit crenarchaeon zijn geconstrueerd uitsluitend gebaseerd op het cryptische pRN2-plasmide.
Het onderzoek, verschenen in mLife , werd geleid door prof. Qunxin She en dr. Guanhua Yuan, beiden van de Shandong Universiteit in Qingdao, China.
"Er is een dubbel gastheer-vectorsysteem nodig om de genetische gereedschapskist voor dit modelarchaeon te verrijken", zegt prof. She.
In feite bestaan in een vroeg stadium van de ontwikkeling van archaeale vectoren zowel pRN1- als pRN2-plasmiden die naast elkaar bestaan in de Sa. islandicus REN1H1 werden gebruikt voor het construeren van shuttlevectoren voor Sa. islandicus REY15A gebaseerd op deze twee plasmiden; Van pRN2 afkomstige plasmiden scoorden een hoge transformatiesnelheid en leverden echte transformanten op, terwijl op pRN1 gebaseerde vectoren slechts zeer weinig kolonies opleverden waaruit plasmiden schijnbaar afwezig waren.
"Aangezien CRISPR-arrays vaak spacers bevatten die overeenkomen met verschillende plasmiden in Sulfolobales, vermoedden we dat het genoom van Sa. islandicus REY15A een spacer zou kunnen bevatten die overeenkomt met een sequentie in pRN1, maar niet in pRN2", zegt Dr. Yuan.
Na bepaling van de volledige genoomsequentie van Sa. islandicus REY15A4, draagt het gastheergenoom een spacer (L2S56) die slechts twee mismatches vertoont met een DNA-segment (Target N1) in de coderende sequentie van het pRN1-replicasegen. Experimenten met transformatie-efficiëntie toonden aan dat L2S56-crRNA's tot expressie werden gebracht op een niveau dat voldoende zou kunnen zijn om de I-A-immuniteit op te wekken, maar onvoldoende om de III-B-immuniteit voor plasmide-eliminatie in Sa op te wekken. islandicus REY15A.
Om een functioneel doelwit N1-derivaat te verkrijgen dat de CRISPR-immuniteit van de gastheer omzeilt, ontwierp het team drie DNA-segmenten (N1a, N1b en N1c) op basis van het pRN1-doel, terwijl de ontworpen mutaties in N1a synoniem waren, terwijl N1b en N1c missense mutaties hadden. De resultaten toonden aan dat geen van de drie gemuteerde doelen het doelwit was van het CRISPR-systeem in de archaea-gastheer. Uit daaropvolgende experimenten bleek echter dat N1c de missense-mutaties draagt die mogelijk het replicatie-eiwit hebben geïnactiveerd.
Door de constructie van een reeks vectoren kan de Saccharolobus –E. coli shuttlevector pN1dAA met de N1a-mutaties, argD-selectiemarker, p15A-oorsprong van replicatie en een kanamycine-resistente marker werden ontworpen op basis van de pRN1-skelet, die een stabiele coëxistentie met het van pRN2 afgeleide plasmide pSeSD in Sa kan bereiken. islandicus REY15A-cellen. Dit leverde een duaal plasmidesysteem op voor genetisch onderzoek met dit belangrijke archaeale model.
Omdat onderzoek naar gastheer-plasmide-conflicten een nuttig middel biedt voor de identificatie van compatibele plasmide-vectorsystemen, zijn de gemanipuleerde plasmiden, zodra het conflict experimenteel is opgelost, zeer nuttig voor het ontwikkelen van gastheer-vector-systemen, zoals gerapporteerd in dit artikel.