Synthetische biologen van Rice University hebben de eerste technologie ontwikkeld voor het observeren van de realtime activiteit van enkele van de meest voorkomende signaalverwerkingscircuits in bacteriën, waaronder dodelijke pathogenen die de circuits gebruiken om hun virulentie te verhogen en om resistentie tegen antibiotica te ontwikkelen.

Tweecomponentensystemen zijn sensorische circuits die bacteriën gebruiken om op hun omgeving te reageren en te overleven. Bacteriën gebruiken de circuits, die ook bekend staan ​​als signaaltransductieroutes, om een ​​"ongeëvenaard scala aan stimuli" waar te nemen, van licht- en metaalionen tot pH en zelfs berichten van hun vrienden en buren, zei Rice bio-ingenieursprofessor Jeffrey Tabor.

Tabor en postdoctoraal onderzoeker Ryan Butcher's nieuwe optische hulpmiddel voor het observeren van realtime fosforyleringsreacties in tweecomponentensystemen wordt beschreven in een studie die deze week is gepubliceerd in de Proceedings of the National Academy of Sciences .

"Bacteriën gebruiken tweecomponentensystemen om virulentie en antibioticaresistentie te activeren, menselijke en plantaardige gastheren te koloniseren, biofilms te vormen en medische apparaten te vervuilen", zegt Tabor, een professor in zowel bio-engineering als biowetenschappen.

Het laboratorium van Tabor heeft jarenlang tweecomponentensystemen bestudeerd. In 2019 onthulde zijn team een ​​biohacking-toolkit die synthetische biologen zouden kunnen gebruiken om tienduizenden sensorische inputs en genetische outputs van de circuits te mixen en matchen.

Een van de belangrijkste toepassingen van die toolkit was het ontrafelen van het dubbele mysterie van tweecomponentensystemen. Zoals hun naam al aangeeft, hebben de circuits twee functies:een stimulus buiten de cel waarnemen en het gedrag van de cel veranderen als reactie op die stimulus.

De eerste component, bekend als een sensorkinase, steekt typisch door de buitenwand van de cel en kan alleen worden geactiveerd door een specifiek chemisch signaal. Eenmaal geactiveerd, zet het een biochemische cascade in gang, een kettingreactie in de cel die eindigt met de cel die zijn gedrag verandert als reactie op de stimuli.

De eerste stap in de cascade is een proces dat fosforylering wordt genoemd en dat uiteindelijk resulteert in activering van de tweede component van het systeem, de responsregulator.

Hoewel fosforyleringsreacties de sleutel zijn in de tienduizenden tweecomponentensystemen die in bacteriën worden gebruikt, was het erg moeilijk om ze direct in levende bacteriën waar te nemen. Dat komt deels omdat responsregulatoren zich doorgaans moeten verenigen om paren te vormen om de biologische cascade voort te zetten die leidt tot stimulusrespons.

"Experimentele analyse van fosforylering vereist vaak zuivering van eiwitten uit bacteriën en analyse met behulp van bewerkelijke in vitro methoden zoals gelelektroforese," zei Butcher.

Butcher creëerde een veel eenvoudigere methode die fluorescerende eiwittags en gepolariseerd fluorescerend licht gebruikt. Hij ontwikkelde stammen van E. coli om mNeonGreen-fluorescerende eiwitprobes te produceren die het licht van een excitatielaser depolariseren, maar alleen als ze als paren op elkaar inwerken. In verschillende tests hebben Butcher en Tabor aangetoond dat hun methode kan worden gebruikt om de omvang en snelheid van de activering van de responsregelaar onder verschillende omgevingsomstandigheden te controleren.

De methode wordt "homotypische fluorescentieresonantie-energieoverdracht" of kortweg homo-FRET genoemd. Tabor zei dat onderzoekers het kunnen gebruiken om de activering van tweecomponentensystemen te volgen met een veel hogere tijdresolutie dan voorheen mogelijk was.

In de studie demonstreerden hij en Butcher het nut van homo-FRET door een nitraat-geactiveerd tweecomponentensysteem te observeren waarvan bekend is dat het een rol speelt bij gastro-intestinale kolonisatie door E. coli, Salmonella en andere pathogenen.

"Microbiologen weten al een tijdje dat dit genetische circuit wordt gebruikt door een aantal ziekteverwekkers, maar we begrijpen nog steeds niet helemaal hoe het werkt," zei Tabor.

Met behulp van hun methode ontdekten Tabor en Butcher een voorheen niet-gerapporteerde activiteitspuls in het circuit als reactie op het toevoegen van nitraat. De puls lijkt te ontstaan ​​door snelle activering van het tweecomponentensysteem gevolgd door consumptie van nitraat door de bacteriën en de bijbehorende deactivering.

"Dat is een kijkje in hoe dit circuit werkt, en het is iets dat veel moeilijker zou zijn geweest om met eerdere methoden vast te stellen," zei Tabor. "Met homo-FRET kunnen we zien hoe het circuit reageert op veranderende nitraatniveaus terwijl het gebeurt."

"We denken dat homo-FRET kan worden gebruikt om biosensoren te ontwikkelen die 10 keer sneller reageren dan de huidige alternatieven, en dat wij en anderen het kunnen gebruiken om nieuwe ontdekkingen te doen in een reeks andere bacteriële routes," zei hij. + Verder verkennen

Synthetische biologen hacken bacteriële sensoren