Onderzoekers van de McKelvey School of Engineering aan de Washington University in St. Louis hebben een nieuwe techniek ontwikkeld die beeldvorming met een hogere resolutie van zeer kleine objecten zoals neuronen mogelijk zal maken. De techniek, die een verbetering is van een bestaande methode genaamd expansiemicroscopie, wordt beschreven in een nieuw artikel gepubliceerd in het tijdschrift Nano Letters .

De meeste mensen zijn bekend met microscopen die lenzen gebruiken om een ​​object groter te laten lijken en gemakkelijker zichtbaar te maken voor het menselijk oog. Maar expansiemicroscopie (ExM) werkt vrijwel op de tegenovergestelde manier:door het object zelf groter te maken. Wetenschappers bedekken het monster – een cel bijvoorbeeld – met kleine lichtgevende markeringen, fluoroforen genaamd, en sluiten het monster vervolgens in in een gel die uitzet als het in contact komt met water. Naarmate het monster groter wordt, tekenen de fluorescerende labels de contouren van kenmerken die te klein zijn om te zien, zoals de dunne takken of dendrieten die uit hersencellen groeien.

Maar expansiemicroscopie heeft een grote tekortkoming. Het lichtsignaal dat wordt uitgezonden door conventionele fluoroforen verliest veel van zijn intensiteit (meer dan 50%) tijdens de voorbereidings- en expansiestappen.

"Als je dingen groter maakt, is dat niet per se goed, want als je de hoeveelheid signaal die al aanwezig is niet verandert, wordt dat signaal zwakker", zegt Barani Raman, hoogleraar biomedische technologie.

Raman en Srikanth Singamaneni, de Lilyan &E. Lisle Hughes hoogleraar bij de afdeling Werktuigbouwkunde en Materiaalkunde, hebben dit probleem aangepakt door ultraheldere fluorescerende markers te gebruiken die plasmonische fluors (PF's) worden genoemd. Singamaneni ontwikkelde de PF's in 2020 voor andere toepassingen.

"Het is een mooi voorbeeld van twee mensen met totaal verschillende expertise die een toevallig gesprek voeren en zeggen:'Oké, dit probleem ligt hier op het ene gebied, maar de oplossing ligt op een ander gebied'", zei Raman. Het team heeft zijn nieuwe techniek de naam gegeven "plasmon-versterkte expansiemicroscopie", of p-ExM.

Het plasmonische fluor is opgebouwd uit een kerndeeltje van goud, gewikkeld in een zilveren omhulsel, dat vervolgens wordt bedekt met een laag andere materialen, waaronder conventionele fluoroforen. De structuur is ontworpen om de fluoroforen te beschermen tegen de agressieve chemicaliën die in het proces worden gebruikt en om het lichtsignaal van de fluoroforen veel helderder te maken. De techniek zal onderzoekers helpen bij het in kaart brengen van neurale netwerken, oftewel de verbindingen tussen neuronen.

"Het metalen nanodeeltje dient als antenne, wat betekent dat het meer licht in de fluoroforen kan trekken", zei Singamaneni. De interactie tussen het goud-zilveren nanodeeltje en de fluoroforen zorgt er ook voor dat de fluoroforen meer fotonen uitzenden dan normaal. Als gevolg hiervan is het plasmonische fluor bijna vier ordes van grootte helderder dan de fluorescerende markers op zichzelf zouden zijn. Plasmonische fluorverbindingen lossen ook het probleem van signaalverdunning op, omdat de fluorescerende markers rechtstreeks aan het nanodeeltje zijn bevestigd, zodat ze zich niet uit elkaar verspreiden als het monster uitzet.

Om het potentieel van plasmon-versterkte expansiemicroscopie aan te tonen, gebruikten de onderzoekers het om een ​​monster neuronen uit het hippocampusgebied van de hersenen te bestuderen. In sommige gevallen zijn de ontluikende takken van het neuron, neurieten genaamd, te dicht bij elkaar om te onderscheiden zonder de hulp van technieken zoals expansiemicroscopie.

"Als twee neurieten te dicht bij elkaar staan, kunnen we ze niet oplossen. De software denkt dat ze maar één neuriet zijn", aldus Singamaneni.

Na het labelen van de cellen met de ultraheldere plasmonische fluorescerende stoffen en het uitbreiden van het monster, kon het team het aantal neurieten tellen, het totale oppervlak van de neurieten kwantificeren en de lengte van individuele neurieten meten. Ze identificeerden 2,5 keer meer neurieteindpunten dan zichtbaar waren voordat het monster werd uitgebreid.

Toen het team de prestaties van het plasmonische fluor vergeleek met de fluoroforen zelf, ontdekten ze dat het plasmonische fluor ongeveer 76% van het lichtsignaal vasthield, terwijl de fluoroforen minder dan 16% vasthielden. De resultaten van het team toonden ook aan dat plasmon-versterkte expansiemicroscopie compatibel is met bestaande expansiemicroscopieprotocollen, wat betekent dat plasmonische fluorescerende stoffen in toekomstige studies kunnen worden gebruikt in plaats van conventionele fluoroforen. PF's kunnen ook worden gemaakt van elke willekeurige fluorofoor die voldoet aan de behoeften van onderzoekers.

Meer informatie: Priya Rathi et al., Plasmon-Enhanced Expansion Microscopie, Nano Letters (2023). DOI:10.1021/acs.nanolett.3c01256

Journaalinformatie: Nanobrieven

Aangeboden door de Washington Universiteit in St. Louis