O-gebonden β-N-acetylglucosamine (O-GlcNAcylation), een belangrijke post-translationele modificatie (PTM) van eiwitten, is betrokken bij verschillende biologische functies.

De omkeerbare modificatie van O-GlcNAc verleent aan-uit-eiwitfuncties tijdens biologische processen. Afwijkingen van O-GlcNAcylering zijn nauw geassocieerd met veel stofwisselingsziekten, samen met de invasie en metastase van verschillende tumoren.

Onlangs heeft een onderzoeksteam onder leiding van Prof. Ye Mingliang en Prof. Qin Hongqiang van het Dalian Institute of Chemical Physics (DICP) van de Chinese Academie van Wetenschappen (CAS), in samenwerking met Prof. Huang Wei van het Shanghai Institute of Materia Medica van CAS, een nieuwe strategie ontwikkeld voor omkeerbare chemo-enzymatische labeling van O-GlcNAc-glycopeptiden, wat een diepgaande analyse van eiwit-O-GlcNAcylering mogelijk maakte.

Hun bevindingen werden gepubliceerd in Angewandte Chemie op 14 maart.

Om de proteoombrede analyse van O-GlcNAcylering mogelijk te maken, is het essentieel om glycopeptiden selectief te verrijken uit de verteringen van complexe monsters.

Veel onderzoekers hebben gezocht naar de verrijking van O-GlcNAcylated peptiden vóór analyse door vloeistofchromatografie met tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS). De meeste benaderingen hebben echter last van zwakke bindingsaffiniteit of omvangrijke tags, die de verrijking en identificatie van O-GlcNAcylated peptiden verstoren.

In deze nieuw ontwikkelde strategie werden de O-GlcNAc-resten geligeerd met lange N-glycanen met behulp van een Endo-M-mutant, wat de verrijking van de gelabelde glycopeptiden door hydrofiele interactie-vloeistofchromatografie (HILIC) mogelijk maakte. Vervolgens werden de aangehechte glycanen op de verrijkte glycopeptiden verwijderd door wildtype Endo-M/S om de O-GlcNAc-groep te herstellen.

Vergeleken met de klassieke chemo-enzymatische labeling, maakte deze benadering de tag-vrije identificatie mogelijk en elimineerde de interferentie van omvangrijke tags bij de detectie van glycopeptiden.

Bovendien identificeerden de onderzoekers door deze methode te gebruiken 657 potentiële O-GlcNAc-glycosieten van slechts 0,4 mg HeLa-celkerneiwitten, wat slechts 1/10 van eiwitmonsters nodig was voor een vergelijkbare O-GlcNAcyleringsanalyse, wat de hoge gevoeligheid van dit aangeeft. methode.

In totaal identificeerden ze 1.414 glycosieten uit slechts 1,1 mg eiwitmonsters, en 45% daarvan was niet opgenomen in O-GlcNAcAltas van alle menselijke monsters in de afgelopen 35 jaar, wat de analysedekking van eiwit-O-GlcNAcylatie verbeterde.

"Deze tag-vrije verrijkingsstrategie vertegenwoordigt een unieke weg voor proteoombrede analyse van O-GlcNAcylation en bevordert de mechanismestudies", zei prof. Ye. + Verder verkennen

De moleculaire mechanismen van de ziekte van Alzheimer