Onderzoekers van de Kobe University hebben met succes een tyrosinechassis (een stam van micro-organismen met een hoge tyrosineproductiviteit) ontwikkeld in de gist Pichia pastoris door middel van rationele engineering. Bovendien gebruikten ze dit tyrosinechassis om slimme cellen te ontwikkelen die respectievelijk de van planten afgeleide verbindingen resveratrol, naringenine, norcoclaurine en reticuline kunnen produceren. Deze verbindingen hebben een breed scala aan toepassingen; ze worden bijvoorbeeld gebruikt om voeding toe te voegen aan voedingsmiddelen en als grondstof voor medicijnen. Het is te hopen dat dit tyrosinechassis kan worden gebruikt als startpunt voor biosynthese met hoge opbrengst van verschillende nuttige verbindingen en generieke chemicaliën.

Deze studie van de Kobe University werd uitgevoerd door een onderzoeksgroep met onder meer Ph.D. student Kumokita Ryota (Graduate School of Science, Technology and Innovation) en professor Hasunuma Tomohisa (Engineering Biology Research Center).

Deze onderzoeksresultaten zijn gepubliceerd in het internationale wetenschappelijke tijdschrift ACS Synthetic Biology op 16 mei 2022.

Bioactieve plantaardige aromatische verbindingen zoals stilbenoïden, flavonoïden en benzylisochinoline-alkaloïden (BIA's) worden geproduceerd uit tyrosine. Deze verbindingen hebben een breed scala aan toepassingen in vele industrieën, waaronder de chemische productie, de voedsel-, cosmetische en farmaceutische industrie. Deze aromatische verbindingen worden momenteel geproduceerd door directe extractie uit planten, maar er worden slechts kleine hoeveelheden in planten aangetroffen en de opbrengst is sterk afhankelijk van het weer en het klimaat. Er is geen stabiele aanvoer.

In de afgelopen jaren hebben vorderingen in de synthetische biologie geleid tot de ontwikkeling van technieken om bruikbare verbindingen te produceren. Deze technieken maken gebruik van het vermogen van micro-organismen om stoffen te produceren door van planten afkomstige metabole routes in het micro-organisme te introduceren, zodat het de doelverbinding zal produceren. Van de micro-organismen hebben gisten aandacht gekregen als gastheren voor de productie van verbindingen omdat ze uitblinken in het biosynthetiseren van van planten afgeleide verbindingen. Het potentieel van gisten voor het produceren van van tyrosine afgeleide verbindingen was echter onduidelijk, aangezien er weinig successen waren gemeld.

In deze studie begonnen de onderzoekers met het maken van een giststam die hoge opbrengsten aan tyrosine kon produceren. Met deze nieuwe soort als uitgangspunt, hebben ze veranderingen aangebracht in het metabolisme om het bovengenoemde doel te bereiken, namelijk het produceren van hoge opbrengsten van verschillende bruikbare verbindingen. Het type gist waar ze zich op richtten was P. pastoris. P. pastoris vermenigvuldigt zich snel onder aerobe omstandigheden en produceert geen fermentatieve bijproducten (ethanol), wat betekent dat het de potentie heeft om in korte tijd hoge opbrengsten van een doelverbinding te produceren. Er waren echter geen studies gerapporteerd over de productie van van tyrosine afgeleide verbindingen in P. pastoris en het was niet bekend welke genen bruikbaar zouden zijn voor het produceren van hoge opbrengsten. Terwijl ze een eenvoudige evaluatie deden van de hoeveelheid geproduceerde tyrosine, zochten de onderzoekers ook naar genen die de tyrosineproductie verbeteren. Vervolgens evalueerden ze het potentieel van P. pastoris voor de biosynthese van van tyrosine afgeleide bruikbare verbindingen door biosyntheseroutes in de gist te introduceren voor elk van de volgende:de stilbenoïde resveratrol, de flavonoïde naringenine en de BIA's norcoclaurine en reticuline.

Allereerst gingen de onderzoekers op zoek naar genen in giststammen die de aanmaak van tyrosine stimuleren. Om dit te doen, richtten ze zich op betaxanthine, dat kan worden geproduceerd uit tyrosine in een reactie in drie stappen (Figuur 1).

Betaxanthine is een geel pigment dat groene fluorescentie afgeeft. Daarom is het gemakkelijk om de sterkte van de metabole flux naar tyrosine te evalueren door te kijken naar de intensiteit en kleur van de fluorescentie. Bij het maken van deze evaluatiemethode ontdekten de onderzoekers genen die de tyrosineproductiviteit verbeterden en gebruikten deze kennis om met succes een stam van P. pastoris met een hoge tyrosineproductiviteit te ontwikkelen (Figuur 2).

Het volgende doel van de onderzoekers was om de productiesnelheid van verschillende bruikbare tyrosine-afgeleide verbindingen te verbeteren door het metabolisme van de hoge productiviteitsstam te wijzigen. Ze slaagden erin om de productie van resveratrol, naringenine en norcoclaurine aanzienlijk te verbeteren door voor elk specifieke biosyntheseroutes te introduceren (Figuur 1), waaruit bleek dat P. pastoris hoge opbrengsten aan van tyrosine afgeleide verbindingen kan produceren (Figuur 3).

Vervolgens analyseerde de onderzoeksgroep uitgebreid de intracellulaire metabolieten in de nieuwe P. pastoris-stam die ze ontwikkelden en onderzocht het mechanisme voor hoge tyrosineproductiviteit. De resultaten onthulden dat grote aantallen metabolieten van de shikimaatroute die betrokken zijn bij de tyrosine- en tyrosinesynthese zich ophoopten in de gemanipuleerde stam (Figuur 4). Deze resultaten tonen aan dat het modificeren van het metabolisme met succes de metabole flux naar tyrosine verhoogde. Er is toekomstig potentieel om de productie van nuttige verbindingen die kunnen worden gebiosynthetiseerd uit tyrosine verder te verhogen door het metabolisme van de shikimaat-route te optimaliseren.

Ten slotte wilden de onderzoekers tyrosine-afgeleide verbindingen produceren via fermentatie met ruwe glycerol als groeimedium. Ruwe glycerol is een belangrijk afvalbijproduct van de productie van biodieselbrandstof (een potentieel alternatief voor petrochemische brandstof). De onderzoeksgroep gebruikte de vloeistof (Figuur 5, rechts) verkregen uit het neutraliseren van ruwe glycerol als groeimedium in een microbieel productie-experiment. In dit experiment slaagden ze erin dezelfde hoeveelheden resveratrol, naringenine en norcoclaurine te produceren als wanneer pure glycerol werd gebruikt. Deze resultaten laten zien dat P. pastoris niet alleen bruikbare verbindingen kan produceren uit pure glycerol, maar ook uit ruwe glycerol.

Het tyrosinechassis dat door dit onderzoek is ontwikkeld, kan worden toegepast op de fermentatieve productie van verschillende nuttige verbindingen en generieke chemicaliën die kunnen worden gebiosynthetiseerd uit tyrosine. Bovendien hopen de onderzoekers de productie van van tyrosine afgeleide verbindingen verder te verhogen door de resultaten van de metaboloomanalyse van hun nieuwe P. pastoris-stam te gebruiken als basis voor optimalisatie van de metabole route. + Verder verkennen

Ontdekking van nieuw fenomeen een game-changer voor efficiënte bioproductie van nuttige chemicaliën