Microbiële secundaire metabolieten, die moleculen die niet essentieel zijn voor groei maar wel essentieel om te overleven, kunnen nu gemakkelijker te karakteriseren zijn na een proof-of-concept-onderzoek waarin onderzoekers CRISPR- en CRAGE-technologieën combineerden.

Hoewel CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) het belangrijkste hulpmiddel is voor het nauwkeurig bewerken van genomen, is de effectiviteit ervan in het verleden beperkt geweest vanwege het ontbreken van robuuste hulpmiddelen die beschikbaar zijn om CRISPR in micro-organismen te brengen. CRAGE (Chassis-independent Recombinase-Assisted Genome Engineering) is een techniek die onderzoekers kunnen gebruiken om grote genetische ladingen rechtstreeks in diverse microben te integreren.

De combinatie van CRAGE met CRISPR biedt onderzoekers een krachtige aanvulling op hun toolkit om de genfunctie te bestuderen. Als demonstratie gebruikten de onderzoekers CRAGE-CRISPR om actieve secundaire metabolieten te ontdekken en hen te helpen bij het identificeren en beschrijven van de functies van de biosynthetische genclusters die ze produceren.

Secundaire metabolieten zijn microbiële verbindingen die worden geproduceerd als reactie op ontberingen of concurrentie. Ze vormen de basis voor een hele reeks essentiële producten in de biotechnologie, medicijnen, landbouw en andere industrieën - maar er is nog zoveel dat we niet weten.

Het ontsluiten van de kracht van secundaire metabolieten kan ingewikkeld zijn omdat de BGC's die ze produceren niet kunnen worden geactiveerd in laboratoriumomgevingen. CRAGE heeft enige vooruitgang geboekt bij het overwinnen van dit obstakel toen het in 2019 op de markt kwam. Nu staat die kracht klaar om exponentieel te groeien door het te combineren met CRISPR.

Door CRAGE te gebruiken, zijn onderzoekers niet langer beperkt tot het gebruik van modelgastheermicroben; theoretisch kan elke microbe dienen als fabriek voor het produceren van chemische verbindingen van belang. Door CRAGE te gebruiken om doelmicroben te domesticeren, kunnen JGI-gebruikers CRISPR vervolgens gebruiken in een verscheidenheid aan microbiële gastheren.

Photorhabdus luminescens blijkt dodelijk voor insecten. Het wordt gedragen door een infectieuze nematode en geeft gifstoffen af ​​in de bloedbaan van het insect die de gastheer snel doden. Als u precies begrijpt hoe P. luminescens en zijn secundaire metabolieten werken, zou dit nieuwe hulpmiddelen voor ongediertebestrijding kunnen opleveren.

Secundaire metabolieten zijn sterk gereguleerd in bacteriën, waardoor het moeilijk is om te bepalen welke route overeenkomt met welke metaboliet. Het vinden van een voertuig waarmee CRISPR in de microbe kan worden geïntroduceerd, is van cruciaal belang, omdat het onderzoekers in staat stelt bepaalde genen te verwijderen of te activeren en te beoordelen hoe deze bewerkingen de functionaliteit beïnvloeden.

CRAGE maakt de transplantatie van deze BGC's van het ene organisme naar een alternatieve gastheer mogelijk via een landingsplaats die bestaat uit een cre-recombinase-gen en elkaar uitsluitende lox-sites. Uiteindelijk stelt dit proces onderzoekers in staat om stammen te identificeren die in staat zijn om secundaire metabolieten te produceren in een laboratoriumomgeving, en een licht schijnen op deze 'biologische donkere materie'.

Het biedt ook CRISPR een toegangspunt. Door CRISPR te gebruiken om genen uit te schakelen of te activeren, konden onderzoekers van het JGI de functieverlies en -winst volgen. De analytische gegevens van het onderzoek tonen pieken en dalen in secundaire metabolieten terwijl genen worden bewerkt. Met behulp van CRAGE bleek de koppeling snel de verhoogde productie van 22 metabolieten uit zes biosynthetische genclusters te bevestigen. Een daarvan was een metaboliet van een voorheen niet-gekarakteriseerde biosynthetische genencluster. Dat werk van JGI-onderzoekers werd in april 2022 gepubliceerd in Cell Chemical Biology .

Als het specifiek gaat om insectenverdelger P. luminescens, zou het begrijpen van de secundaire metabolieten en hun routes kunnen leiden tot verdere landbouwtoepassingen voor ongediertebestrijding en inzicht in hoe de ziekteverwekker insecten als brandstof gebruikt.

De impact van de koppeling zou veel verstrekkender kunnen zijn. De compatibiliteit van CRAGE en CRISPR zou het mogelijk kunnen maken om CRISPR in andere bacteriën te introduceren, waardoor de wetenschappelijke gemeenschap beter begrijpt hoe secundaire metabolieten worden geproduceerd en hoe ze hun krachten kunnen benutten in de landbouw, farmaceutische producten, biobrandstoffen en daarbuiten. + Verder verkennen

De biochemische schatkist in microben ontgrendelen