Om te begrijpen hoe individuele moleculen hun rol spelen in biologische processen in de cellen waarin ze zijn gesynthetiseerd, onderzoekers hebben superresolutiemicroscopiemethoden ontwikkeld om ze op het niveau van één molecuul te visualiseren. Echter, om hun functies te onderzoeken, uiteindelijk, ze willen ze ook graag individueel kunnen wijzigen met deze hoge resolutie. Hoewel de visualisatie van afzonderlijke moleculen de afgelopen jaren grote vooruitgang heeft geboekt, tot nu toe was het een uitdaging om ze direct te wijzigen in een gecontroleerde, molecuul-naar-molecuul mode.

Nutsvoorzieningen, gemeld in Natuurchemie , onderzoekers van het Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering van Harvard en de Harvard Medical School (HMS), hebben "Action-PAINT, " een methode die de real-time DNA-PAINT-superresolutiemicroscopiebenadering van het team combineert met een single-molecule labelingstrategie op een gewenste locatie binnen synthetische nanostructuren of intacte cellen. Deze benadering zou verder kunnen worden ontwikkeld om onderzoekers in staat te stellen de functies van individuele moleculen en bestudeer de gevolgen voor normale biologische en ziektegerelateerde processen in realtime en superresolutie.

"Met superresolutie-beeldvormingsmethoden hebben we 'het voorheen onzichtbare' kunnen zien." Door onze DNA-PAINT-superresolutiemicroscopiemethode te koppelen aan een crosslinking-benadering, we kunnen nu ook 'het voorheen ontoegankelijke aanraken' door een fysieke handgreep te bevestigen aan individueel waarneembare moleculen op het moment van visualisatie, " zei Peng Yin, kernfaculteitslid van het Wyss Institute, doctoraat, die de studie leidde. Yin is ook mede-leider van het Molecular Robotics Initiative van het Instituut, en hoogleraar systeembiologie aan de HMS.

Het team van Yin ontwikkelde een tweestapsbenadering die eerst afzonderlijke eiwitten of andere moleculen met superresolutie visualiseert, en brengt vervolgens een moleculair label over naar de gewenste doelplaats. Optioneel, de onderzoekers kunnen succesvolle overdrachten bevestigen met een extra ronde beeldvorming met superresolutie.

De eerste stap van beeldvorming met één molecuul is gebaseerd op de DNA-PAINT-methode waarmee het team eerst de precieze lokalisatie van moleculen of moleculaire kenmerken kon bepalen die ruimtelijk gescheiden zijn door afstanden die ver onder de diffractielimiet van licht liggen, en daarom onzichtbaar voor de meeste microscopen. De onderzoekers bevestigden eerst een korte "docking-streng" van DNA aan het doelwit dat dient als een bindingsplaats voor een complementaire "imager-streng" die een fluorescerende kleurstof draagt. Omdat de imager-streng bindt met een programmeerbare aan-uit-snelheid, het produceert gedefinieerde "knipperende" gebeurtenissen die kunnen worden waargenomen met behulp van standaardmicroscopen. Om een ​​fysiek label aan het doel te bevestigen, de onderzoekers voerden hun eerste beeldvormingsstap met superresolutie uit met een iets complexere imager-streng die ook een foto-induceerbare crosslinker bevatte, die in staat is om de docking- en imager-streng chemisch aan elkaar te koppelen bij blootstelling aan UV-straling, en een extra reportersequentie.

"Een cruciaal onderdeel van onze nieuwe methode is de nauwkeurige besturing van de crosslinking-laser, die synchroon werkt met de knippervolgorde met superresolutie. Dit zet onze DNA-PAINT superresolutiemicroscopie echt om van een passieve beeldvormingsmethode naar een actieve, waardoor realtime interactie tussen de onderzoeker en individuele moleculaire doelen mogelijk is, " zei co-eerste en co-corresponderende auteur Mingjie Dai.

Om deze nieuwe mogelijkheid mogelijk te maken, het team ontwikkelde een softwarepakket waarmee ze eerst de precieze locaties van alle moleculaire doelen in een interessegebied in kaart konden brengen met behulp van de DNA-PAINT-methode, en synchroniseer vervolgens het knipperen van een UV strak met daaropvolgende knippergebeurtenissen. "Op deze manier konden we de imager-streng chemisch binden aan op maat geselecteerde moleculaire doelen, een voor een, met moleculaire resolutie - zoals een schilder zijn kleur vastlegt, patch voor patch in de stijl van het pointillisme, " zei Dai, doctoraat, een voormalig postdoctoraal fellow in het team van Yin, die momenteel een Departmental Fellow is bij HMS's Department of Systems Biology and Technology Development Fellow bij het Wyss Institute.

Om de effectiviteit en selectiviteit van hun aanpak aan te tonen, het team gebruikte voor het eerst synthetische DNA-nanostructuren die aanlegplaatsen voor imager-strengen in gedefinieerde patronen blootlegden. "Action-PAINT aan het werk zetten, we zijn begonnen met het aantonen van de effectiviteit ervan door enkelvoudige moleculen te labelen die zich op slechts 30 tot 70 nm van hun identieke buren bevinden met een hoge on-target efficiëntie, " zei co-eerste auteur Ninning Liu, doctoraat, "en vervolgens onze methode verder gevalideerd in vaste cellen, waar we microtubule-eiwitten langs cytoskeletfilamenten selecteerden en labelden, met verschillende op maat gedefinieerde patronen." Liu is een postdoctoraal onderzoeker in het team van Yin.

De auteurs voorzien dat Action-PAINT verder kan worden ontwikkeld tot een breed toepasbare tool die, bijvoorbeeld, zou kunnen helpen de activiteiten van enkele membraanreceptoren op het oppervlak van cellen direct te wijzigen van waaruit ze het celgedrag sturen, of van ionenkanalen die de functie van neuronale cellen regelen. In aanvulling, de methoden kunnen de overdracht van moleculaire handvatten naar afzonderlijke eiwitten mogelijk maken die hun extractie en zuivering mogelijk maken samen met andere eiwitten waaraan ze van nature binden.

"Action-PAINT voegt nog een ander niveau van functionaliteit toe aan de mogelijkheden die zijn ontwikkeld door het team van Peng Yin die zowel moleculaire positiegebaseerde functionele eiwitinteractie-mapping in individuele cellen mogelijk maken, en biochemische analyse van deze interacties zodra deze moleculen zijn geïsoleerd, die in de toekomst zouden kunnen helpen bij het identificeren en/of valideren van nieuwe doelwitten voor geneesmiddelen, " zei Donald Ingber, oprichter van het Wyss Institute, MD, doctoraat