Voor de eerste keer, wetenschappers van ASU's School of Molecular Sciences hebben in samenwerking met collega's van het Albert Einstein College of Medicine in New York City snapshots gemaakt van kristalstructuren van tussenproducten in de biochemische route die ons in staat stelt te ademen.

Vandaag gepubliceerd in de Proceedings van de National Academy of Sciences -Momentopname van een zuurstofintermediair in de katalytische reactie van cytochroom c-oxidase - hun resultaten bieden belangrijke inzichten in de laatste stap van aerobe ademhaling.

"Er is een team voor nodig om zo'n geavanceerd experiment uit te voeren, ", legt universitair hoofddocent Alexandra Ros van SMS uit, die, samen met haar afstudeerstudent Austin Echelmeier en oud-stagiair Gerrit Brehm, ontwikkelde de hydrodynamische focusseermixer die deze experimenten mogelijk maakt.

De mixer is een microfluïdisch apparaat, dat is een hoge resolutie, 3D-geprint en maakt het mogelijk om twee stromen van met zuurstof verzadigde buffer perfect te mengen met een centrale stroom die rundercytochroom-c-oxidase (bCcO)-microkristallen bevat. Dit initieert een katalytische reactie tussen de zuurstof en de microkristallen.

In het begin

Dit onderzoek kwam tot stand door een gesprek tussen SMS-professor Petra Fromme, directeur van het Center for Applied Structural Discovery (CASD) van het Biodesign Institute, Raimund Fromme, SMS universitair hoofddocent, en professor Denis Rousseau van het Albert Einstein College of Medicine in New York City, die werkt aan de structuur van cytochroom-c-oxidase, een sleutelenzym dat betrokken is bij aerobe ademhaling.

Cytochroom-c-oxidase (CcO) is het laatste enzym in de respiratoire elektronentransportketen van cellen die zich in het mitochondriale membraan bevinden. Het ontvangt een elektron van elk van de vier cytochroom c-moleculen, en brengt ze over naar één zuurstofmolecuul (twee atomen), het omzetten van de moleculaire zuurstof in twee moleculen water.

Onderzoekers van CASD, waaronder ASU's Richard Snell hoogleraar natuurkunde, John Spence, hielp bij het pionieren van een nieuwe techniek genaamd tijdopgeloste seriële femtoseconde (miljoenste van een miljardste van een seconde) kristallografie (TR-SFX). Deze techniek maakt gebruik van een X-ray Free Electron Laser (XFEL) bij het SLAC National Accelerator Laboratory van het Department of Energy (DOE), Stanford.

SFX is een veelbelovende techniek voor het bepalen van de eiwitstructuur, waar een vloeistofstroom met eiwitkristallen wordt doorsneden met een XFEL-straal met hoge intensiteit die een miljard keer helderder is dan traditionele synchrotron-röntgenbronnen.

Terwijl de kristallen breken en onmiddellijk daarna worden vernietigd door de intense XFEL-straal, de resulterende diffractiepatronen kunnen worden geregistreerd met ultramoderne detectoren. Er zijn krachtige nieuwe data-analysemethoden ontwikkeld, waardoor een team deze diffractiepatronen kan analyseren en elektronendichtheidskaarten en gedetailleerde structurele informatie van eiwitten kan verkrijgen.

De methode is vooral aantrekkelijk voor moeilijk te kristalliseren eiwitten, zoals membraaneiwitten, omdat het structurele informatie met een hoge resolutie oplevert van kleine micro- of nanokristallen, waardoor de bijdrage van kristaldefecten wordt verminderd en vervelende (zo niet onmogelijke) groei van grote kristallen wordt vermeden, zoals vereist is bij traditionele op synchrotron gebaseerde kristallografie.

Deze nieuwe "diffractie vóór vernietiging"-methode heeft nieuwe wegen geopend voor structurele bepaling van fragiele biomoleculen onder fysiologisch relevante omstandigheden (bij kamertemperatuur en in afwezigheid van cryoprotectanten) en zonder stralingsschade.

CcO reduceert zuurstof tot water en maakt gebruik van de chemische energie om de verplaatsing van protonen (positief geladen waterstofatoom) door het binnenste mitochondriale membraan te drijven door een voorheen onopgelost mechanisme.

Samengevat, de TR-SFX-onderzoeken hebben de structurele bepaling van een belangrijk zuurstoftussenproduct van bCcO mogelijk gemaakt. De resultaten van de experimenten van het team bieden nieuwe inzichten in het mechanisme van protonverplaatsing in het koe-enzym in vergelijking met dat in bacteriële CcO's, en maakt de weg vrij voor de bepaling van de structuren van andere CcO-tussenproducten, evenals voorbijgaande soorten gevormd in andere enzymreacties.