Een van de belangrijkste uitdagingen van proteomics, de studie van alle eiwitten die door een cel of organisme tot expressie worden gebracht, maakt onderscheid tussen moleculen die structureel verschillend zijn en toch dezelfde massa hebben. Dit is moeilijk omdat een massaspectrometer, het belangrijkste apparaat dat in dit soort onderzoek wordt gebruikt, werkt als een weegschaal, het sorteren van de geanalyseerde moleculen op basis van hun massa.

Een manier om verwarring bij het gebruik van een massaspectrometer te verminderen, is door het monster eerst aan vloeistofchromatografie te onderwerpen. die hydrofiele ("waterminnende") eiwitten scheidt van hydrofobe. De hydrofiele eiwitten komen als eerste de spectrometer binnen, en de meest hydrofobe worden voor het laatst achtergelaten, het verminderen van de kans dat twee verschillende moleculen met equivalente massa's door het apparaat als slechts één zullen worden geïnterpreteerd.

"Het is alsof je een legpuzzel met miljoenen stukjes oplost. Als je de zak voor het eerst opent, de stukken zijn allemaal door elkaar gegooid en overlappen elkaar. Je moet beginnen met ze te sorteren. Omdat we met proteomics werken, we streven voortdurend naar de ontwikkeling van meer verfijnde sorteertechnieken, " zei Daniel Martins-de-Souza, hoofd van het Neuroproteomics Laboratory aan de Universiteit van Campinas (UNICAMP) in Brazilië.

In een onderzoek waarvan de resultaten onlangs zijn gepubliceerd in Proteomics , De groep van Martins-de-Souza optimaliseerde een methode om de resolutie van proteomische analyse door massaspectrometrie te verhogen. Dankzij een combinatie van twee andere technieken - tweedimensionale vloeistofchromatografie en ionenmobiliteit - slaagde de groep erin 10, 390 eiwitten tot expressie gebracht in oligodendrocyten, de cellen van het centrale zenuwstelsel die verantwoordelijk zijn voor de productie van myeline, een lipidenstof die een essentiële rol speelt bij de informatie-uitwisseling tussen neuronen.

Met de steun van FAPESP, de UNICAMP-groep heeft jarenlang het proteoom van de menselijke oligodendrocyten bestudeerd, met als doel de oorzaken van schizofrenie beter te begrijpen als basis voor het voorstellen van nieuwe therapeutische benaderingen. "We hebben nu een veel completere database met oligodendrocyt-eiwitten, die nuttig zal zijn voor onze eigen studies en die van andere onderzoekers in het veld, "Zei Martins-de-Souza. "Het is online beschikbaar, en de gegevens kunnen worden gedownload. In aanvulling, de optimalisatietechniek kan worden gebruikt om het proteoom van elk biologisch monster te bestuderen."

In een eerdere studie met behulp van eendimensionale vloeistofchromatografie voor voorsortering, de groep had er slechts 2 geïdentificeerd, 290 eiwitten in oligodendrocyten.

Volgens Martins-de-Souza, momenteel beschikbare behandelingen voor schizofrenie richten zich op neuronen, maar de neurale communicatiestoringen die bij patiënten worden waargenomen, kunnen te wijten zijn aan een disfunctie van de oligodendrocyten. "Een van onze onderzoekslijnen bestaat uit het evalueren hoe de medicijnen die worden gebruikt om schizofrenie onder controle te houden, het oligodendrocyt-proteoom wijzigen, " zei hij. "Met deze nieuwe methode, we kunnen vijf keer meer informatie krijgen over de rol van deze medicijnen."

Het onderzoek is uitgevoerd tijdens het postdoctoraal onderzoek van Juliana Silva Cassoli en het masteronderzoek van Caroline Brandão Teles, beide met beurzen van FAPESP en supervisie door Martins-de-Souza. De eerste stap in proteomische analyse met behulp van massaspectrometrie is het afbreken van de eiwitten die zijn geëxtraheerd uit het biologische monster van belang, die in dit geval bestaat uit oligodendrocyten, in kleinere deeltjes die peptiden worden genoemd.

"Een klein eiwit kan minstens 10 verschillende peptiden opleveren. De spectrometer is niet goed in het analyseren van het hele molecuul vanwege zijn grote omvang, " legde Martins-de-Souza uit.

Volgende, de groep onderwierp het monster aan scheiding door chromatografie. In plaats van een enkele matrix te gebruiken, zoals bij de conventionele techniek, ze gebruikten er twee. Bij de eerste scheiding slechts een vijfde van de geïnjecteerde peptiden kwam in vloeibare vorm de spectrometer binnen. Dit werd gevolgd door nog een vijfde in de tweede scheiding, enzovoort.

"Het is alsof je de puzzelstukjes met beide handen uitspreidt in plaats van met één, ' zei Martins-de-Souza.

Binnen de spectrometer, het monster wordt omgezet in gas en vliegt heen en weer in een vacuüm. Hoe kleiner het peptide, hoe sneller het zijn bestemming bereikt, en het apparaat meet dan zijn massa.

Terwijl de moleculen rondvliegen in de spectrometer, de ionenmobiliteitstechniek injecteert een kleine hoeveelheid gas in het apparaat via een buis.

"De weerstand die het molecuul aan het gas biedt, hangt af van zijn driedimensionale vorm, dus als twee verschillende peptiden met dezelfde massa samen vliegen en we injecteren het gas in de tegenovergestelde richting, ze zullen de neiging hebben om te worden gescheiden door de kracht van weerstand tegen het gas. Het is alsof je twee vellen papier met dezelfde massa oppakt, een tot een bal verfrommelen, en laat ze allebei vallen. Door zijn vorm, het verfrommelde laken zal als eerste de vloer bereiken, " legde Martins-de-Souza uit.

Aan het einde van het experiment, de meer dan 223, 000 peptiden geïdentificeerd door de spectrometer werden gereconstrueerd met behulp van bioinformatica-tools, resulterend in de 10, 390 eiwitten beschreven in de krant. The group also used bioinformatics to map the cellular compartments in which the proteins are located and the biological processes in which they are involved.

"Ideaal, it should be possible to identify at least two peptides per protein. Op die manier, we can be sure a molecule is really present in the sample, since two proteins with two exactly identical peptides are unlikely to occur. In dit onderzoek, about 20% of the proteins were identified by more than 20 peptides, " Martins-de-Souza said.

The methodology enabled the researchers to identify even proteins that were relatively scarce in the sample, d.w.z., in quantities some 10 million times smaller than those of the most highly expressed molecules.

"One of the problems with mass spectrometry is that a very large piece of the jigsaw puzzle may hide several smaller ones. However, with an effective tool to spread out the pieces, you can see practically all of them, " Martins-de-Souza said.