Salk-wetenschappers hebben een nieuwe versie gemaakt van de CRISPR/Cas9-technologie voor het bewerken van het genoom waarmee ze genen kunnen activeren zonder breuken in het DNA te veroorzaken. mogelijk het omzeilen van een grote hindernis voor het gebruik van technologieën voor het bewerken van genen om menselijke ziekten te behandelen.

De meeste CRISPR/Cas9-systemen werken door het creëren van "double-strand breaks" (DSB's) in regio's van het genoom die bedoeld zijn voor bewerking of verwijdering, maar veel onderzoekers zijn tegen het creëren van dergelijke breuken in het DNA van levende mensen. Als proof-of-concept, de Salk-groep gebruikte hun nieuwe aanpak om verschillende ziekten te behandelen, inclusief suikerziekte, acute nierziekte, en spierdystrofie, in muismodellen.

"Hoewel veel studies hebben aangetoond dat CRISPR/Cas9 kan worden toegepast als een krachtig hulpmiddel voor gentherapie, er zijn groeiende zorgen over ongewenste mutaties die worden gegenereerd door de dubbelstrengige breuken door deze technologie, " zegt Juan Carlos Izpisua Belmonte, een professor in Salk's Gene Expression Laboratory en senior auteur van het nieuwe artikel, gepubliceerd in Cel op 7 dec. 2017. "We hebben die zorg kunnen omzeilen."

In het originele CRISPR/Cas9-systeem, het enzym Cas9 is gekoppeld aan gids-RNA's die het op de juiste plek in het genoom richten om DSB's te creëren. Onlangs, sommige onderzoekers zijn begonnen met het gebruik van een "dode" vorm van Cas9 (dCas9), die zich nog op specifieke plaatsen in het genoom kunnen richten, maar knipt niet langer DNA. In plaats daarvan, dCas9 is gekoppeld aan transcriptionele activeringsdomeinen - moleculaire schakelaars - die gerichte genen inschakelen. Maar het resulterende eiwit - dCas9 dat aan de activatorschakelaars is bevestigd - is te groot en omvangrijk om in het voertuig te passen dat doorgaans wordt gebruikt om dit soort therapieën aan cellen in levende organismen te leveren. namelijk adeno-geassocieerde virussen (AAV's). Het ontbreken van een efficiënt toedieningssysteem maakt het erg moeilijk om deze tool in klinische toepassingen te gebruiken.

Het team van Izpisua Belmonte combineerde Cas9/dCas9 met een reeks verschillende activatorschakelaars om een ​​combinatie te ontdekken die werkte, zelfs als de eiwitten niet aan elkaar waren gefuseerd. Met andere woorden, Cas9 of dCas9 was verpakt in één AAV, en de schakelaars en gids-RNA's werden in een andere verpakt. Ze optimaliseerden ook de gids-RNA's om ervoor te zorgen dat alle stukjes op de gewenste plaats in het genoom terechtkwamen, en dat het beoogde gen sterk geactiveerd was.

"De componenten werken allemaal samen in het organisme om endogene genen te beïnvloeden, " zegt Hsin-Kai (Ken) Liao, een stafonderzoeker in het Izpisua Belmonte-lab en co-eerste auteur van het nieuwe artikel. Op deze manier, de technologie werkt epigenetisch, wat betekent dat het de genactiviteit beïnvloedt zonder de DNA-sequentie te veranderen.

Om de methode te testen, de onderzoekers gebruikten muismodellen van acuut nierletsel, type 1 diabetes en een vorm van spierdystrofie. In ieder geval, ze ontwikkelden hun CRISPR/Cas9-systeem om de expressie van een endogeen gen te stimuleren dat mogelijk ziektesymptomen zou kunnen omkeren. In het geval van een nierziekte, ze activeerden twee genen waarvan bekend is dat ze betrokken zijn bij de nierfunctie, en observeerde niet alleen verhoogde niveaus van de eiwitten die met die genen zijn geassocieerd, maar verbeterde nierfunctie na een acuut letsel. Voor type 1-diabetes, ze waren gericht op het stimuleren van de activiteit van genen die insulineproducerende cellen zouden kunnen genereren. Alweer, de behandeling werkte, het verlagen van de bloedsuikerspiegel in een muismodel van diabetes. Voor spierdystrofie, de onderzoekers brachten genen tot expressie waarvan eerder is aangetoond dat ze ziektesymptomen omkeren, waaronder één bijzonder groot gen dat niet gemakkelijk kan worden afgeleverd via traditionele virus-gemedieerde gentherapieën.

"We waren erg enthousiast toen we de resultaten bij muizen zagen, " voegt Fumiyuki Hatanaka toe, een onderzoeksmedewerker in het laboratorium en co-eerste auteur van het papier. "We kunnen genactivering induceren en tegelijkertijd fysiologische veranderingen zien."

Het team van Izpisua Belmonte werkt nu aan het verbeteren van de specificiteit van hun systeem en het toepassen ervan op meer celtypen en organen om een ​​breder scala aan menselijke ziekten te behandelen, evenals om specifieke organen te verjongen en het verouderingsproces en leeftijdsgerelateerde aandoeningen zoals gehoorverlies en maculaire degeneratie om te keren. Er zullen meer veiligheidstests nodig zijn voor proeven op mensen, ze zeggen.