Jeff Chao, Junior groepsleider bij de FMI, en zijn groep ontwikkelde een geavanceerde methode om mRNA-afbraak in afzonderlijke cellen te meten. Ze ontwikkelden een fluorescerende biosensor die het mogelijk maakt om intacte transcripten en afbraaktussenproducten te onderscheiden. Deze nieuwe methode, bekend als BEHANDEL, vormt een mooie aanvulling op de eerder ontwikkelde methode, TRICK genoemd, dat de eiwittranslatie meet.

Het leven van een RNA begint in de kern, waar het wordt gesynthetiseerd en verder gemodificeerd – afgetopt, gesplitst en gepolyadenyleerd. Vervolgens gaat het naar het cytoplasma waar het wordt vertaald in een eiwit, en uiteindelijk verslechterd. De hoeveelheid geproduceerd eiwit hangt grotendeels af van de regulatie van transcriptie, maar ook de overvloed aan mRNA. Als leider van de FMI-groep, Jeff Chao wijst erop, "Het is steeds duidelijker geworden dat de regulatie van mRNA-afbraak, vooral tijdens ontwikkeling of snelle veranderingen in het milieu, kan de RNA-niveaus dramatisch beïnvloeden." Hoewel veel van de RNA-afbraakstappen zijn gekarakteriseerd, een duidelijk begrip van wanneer en waar degradatie plaatsvindt, ontbrak tot nu toe.

Jeff Chao en zijn team hebben nu een fluorescentiemicroscopiemethode ontwikkeld waarmee ze de ruimtelijke en temporele dynamiek van de afbraak van afzonderlijke mRNA-moleculen in levende cellen kunnen meten.

Chao en zijn collega's maakten gebruik van een virale RNA-structuur die een knoopachtige structuur vormt. Deze pseudo-knoop voorkomt de afbraak van mRNA door Xrn1, een 5'-3'-exoribonuclease. Chao legt uit:"Met behulp van een veelkleurige biosensor die deze virale pseudo-knopen bevat, we konden onderscheid maken tussen intacte mRNA-transcripten en mRNA-transcripten die worden afgebroken." De wetenschappers noemden deze techniek TREAT for 3(Three)'-RNA End Accumulation during Turnover.

Eerst en vooral, TREAT stelde de wetenschapper in staat om mRNA-afbraak in realtime in levende cellen te observeren. Om degradatie te visualiseren, de wetenschappers ontwikkelden een transcript dat is gelabeld met twee RNA-bindende eiwitten die zijn gefuseerd met twee verschillende fluorescerende tags:een van de eiwitten - PP7 (gelabeld met groen fluorescerend eiwit) - bindt aan het coderende gebied van het mRNA, terwijl de andere - MS2 (met een rode tag) - bindt aan het 3' onvertaalde gebied. Tussen PP7 en MS2, de wetenschappers introduceerden de virale pseudo-knopen. Zo gelabeld, de individuele niet-vertaalde mRNA's lijken geel. Omdat het RNA wordt afgebroken door XRN1, de groen gemarkeerde PP7 is verplaatst. Echter, op de plaats van de pseudo-knoop, XRN1-degradatie stopt, waarmee een kwantificeerbare kleurverandering van geel naar rood kan worden gedetecteerd.

In aanvulling, Chao merkt op:"Met TREAT, we hebben mRNA-verval in afzonderlijke cellen kunnen meten en hebben ontdekt dat individuele afbraakgebeurtenissen onafhankelijk in het cytosol plaatsvinden. De afgebroken mRNA's stapelden zich niet op in verwerkingslichamen. "Dit zijn belangrijke eerste inzichten omdat men dacht dat de verwerkingslichamen een directe rol spelen bij RNA-afbraak. Processing bodies zijn membraanloze compartimenten die zich vormen tijdens faseovergangen. Ze bestaan ​​uit RNA- bindende eiwitten en mRNA's, en omdat ze veel eiwitten bevatten die betrokken zijn bij mRNA-turnover, er werd voorgesteld dat het cellulaire plaatsen van RNA-afbraak zijn.

"TREAT vormt een mooie aanvulling op de andere technologie die we eerder hebben ontwikkeld, TRICK genaamd. Met de selectie van geschikte fluorescerende markers, we kunnen nu zowel RNA-turnover als RNA-translatie 'live' volgen, en we kunnen nagaan hoe deze processen met elkaar verbonden zijn binnen een enkele cel, " zegt Chao.