Het visualiseren van biologische cellen onder een microscoop is zojuist duidelijker gemaakt, dankzij onderzoek uitgevoerd door afgestudeerde student Yifei Jiang en hoofdonderzoeker Jason McNeill van de afdeling chemie van Clemson University.

Met de hulp van Rhonda Powell en Terri Bruce van Clemson's Light Imaging Facility, het team was in staat om een ​​"schakelaar" van nanodeeltjes te ontwikkelen die fluoresceert om de resolutie van microscopische afbeeldingen die kleine cellulaire structuren weergeven, aan te scherpen. Zoals onlangs gepubliceerd in Nano-letters , deze omschakeling is een verbetering van een beeldvormingsmethode die in 2014 de Nobelprijs voor de Scheikunde won.

Omdat cellulaire structuren licht uitzenden bij golflengten kleiner dan 400-700 nanometer op het elektromagnetische spectrum, ze lijken vaak wazig door een lichtmicroscoop. Deze beperking wordt de diffractielimiet genoemd, en het komt voor vanwege de golfeigenschappen van licht. Als licht langs structuren in biologische cellen gaat, het buigt, of bochten, tot een punt dat lichtmicroscopen niet duidelijk kunnen oplossen. De prijswinnende beeldvormingsmethode van 2014 - lokalisatiemicroscopie met één molecuul - is uitgevonden om deze beperking te overtreffen.

"Lokaliseringsmicroscopie met één molecuul is gebaseerd op moleculaire 'fotoschakelaars' - fluorescerende moleculen die je aan en uit kunt zetten, als een lichtschakelaar, om de diffractielimiet te verslaan, " zei McNeill. "Met deze beeldvormingsmethode, het monster wordt één fluorescerend molecuul per keer afgebeeld en een computer wordt gebruikt om een ​​beeld te construeren dat veel scherper is dan wat je zou kunnen krijgen met een gewone lichtmicroscoop."

De vangst, echter, is dat de fluorescentie die door fotoschakelaars wordt geleverd op zijn best zwak is, met slechts een kleine verbetering van de beeldresolutie. Lokaliseringsmicroscopie met één molecuul vereist ook gespecialiseerde apparatuur die duur kan zijn om te verkrijgen.

Cue de "buckyswitch" - de verbeterde versie van een photoswitch van de Clemson-onderzoekers. Dit nieuwe type nanodeeltje behoudt de aan-uitfunctie van de fotoschakelaar, maar is 10 keer helderder en gemakkelijker te gebruiken. Het stelt microscopen ook in staat om beelden vast te leggen tot op terapixelniveau. (Dat is het equivalent van een biljoen pixels, of één miljoen megapixels.)

"Deze nanodeeltjes zijn de eerste fotoschakelaars die een precisie bereiken tot ongeveer 1 nanometer, die de resolutie van beeldvorming met superresolutie aanzienlijk verbetert, " zei Jiang. "Ook, onze methode vereist slechts één excitatielichtbron, waar conventionele superresolutietechnieken twee lasers vereisen; dus, we hebben de opstelling van de microscoop vereenvoudigd."

Jiang monteerde de buckyswitch uit een fluorescentielamp, halfgeleidend geconjugeerd polymeer gecomplexeerd met een chemisch derivaat van buckminsterfullereen:een voetbalvormige vorm van koolstof.

"Het moeilijkste van het maken van een fluorescerend nanodeeltje dat je aan en uit kunt zetten, is dat er veel gebieden zijn die tegelijkertijd fluorescentie uitstralen, " zei McNeill. "In het geval van fluorescerend geconjugeerd polymeer, er zijn tientallen of honderden ketensegmenten. Je kunt proberen een heleboel kleine schakelaars te maken voor elk segment, maar het is moeilijk om ze allemaal tegelijkertijd uit te schakelen. Je kunt ze niet synchroniseren."

Door het derivaat van buckminsterfullereen toe te voegen, genaamd PCBM, tot het maken van buckyswitches, er wordt een "hoofdschakelaar" gevormd die de atomaire lading van de polymeersegmenten regelt, dus het synchroniseren van fluorescentie. PCBM is in staat om elektronen uit het polymeersegment te grijpen, waardoor het segment een algehele positieve lading krijgt. Deze positieve lading vermindert de fluorescentie van nabijgelegen segmenten, die een domino-effect heeft dat de fluorescentie in het hele nanodeeltje uitschakelt.

Bruce - wiens achtergrond de onderwerpen van chemische technologie doorkruist, toegepaste biologie, cellenbiologie, en ervaring in het onderwijs en de industrie - vergelijkt deze beeldvormingsmethode met het zicht op een hangbrug 's nachts.

"De draden van de brug zijn vaak verlicht, en als je ver van de brug staat, de lichten zien eruit als één doorlopend 'koord' van licht, in plaats van losse bollen. Echter, als je de lampen kunt laten knipperen - zodat alleen elke andere lamp op elk moment 'aan' is - kunnen je ogen de afzonderlijke lampen van veraf onderscheiden, Bruce zei. "De basis voor microscopie met superresolutie ligt in het vermogen om fluorescerende labels te laten 'knipperen', net als de lichten op de brug. Het werk dat het laboratorium van Dr. McNeill doet, is van vitaal belang voor de vooruitgang van deze technologie, omdat het erop gericht is die individuele knipperingen veel helderder te maken, zodat onze huidige fotondetectoren de knipperingen daadwerkelijk kunnen zien. Als we de knipperingen kunnen zien met een camera of andere fotondetector, we kunnen in kaart brengen waar het knipperen plaatsvindt, en maak een afbeelding waarin we twee lichtpunten kunnen onderscheiden die zich binnen 10-20 nanometer van elkaar bevinden."

Toen de buckyswitch eenmaal was gesynthetiseerd, Jiang testte het in E. coli, maar niet voordat een uniek groeimedium voor de bacteriën is ontwikkeld. Typisch, E. coli wordt gekweekt in media die autofluorescerend zijn, wat betekent dat het van nature licht uitstraalt. Zonder de juiste media de fluorescentie van de buckyswitch zou worden verduisterd door achtergrondlicht, iets dat Powell onderstreepte.

"Een onderzoek zoals dat van Yifei vereiste heel weinig achtergrondfluorescentie, dus onderzocht ik mediacomponenten die minder snel autofluorescerend zouden zijn en bereidde ik een 'recept' voor een niet-conventioneel, minder autofluorescerende voedingsmedia voor bacteriecultuur, " zei Powell, die zowel biologische wetenschappen als microbiologie heeft gestudeerd aan Clemson voordat hij onderzoekslaboratoriummanager werd van de Clemson Light Imaging Facility. Powell en Bruce werkten ook om Jiang te voorzien van de E. coli voor het onderzoek.

Nadat alle benodigde componenten waren weggewerkt, Jiang bevestigde de nanodeeltjes buckyswitches aan het oppervlak van E. coli. zoals gehoopt, de buckyswitches gaven kleine lichtflitsen, waardoor de onderzoekers hun precieze posities konden bepalen. Vervolgens hebben ze elke lichtflits samengevoegd om de vorm van de E. coli te reconstrueren, wat een superresolutiebeeld oplevert.

"We hopen dat deze doorbraak uiteindelijk in staat zal zijn om onderzoekers te helpen moeilijke problemen in de biologie aan te pakken, leiden tot doorbraken in het begrijpen en behandelen van ziekten, ', zei het Clemson-team.

Het team heeft de buckyswitches ontworpen om te werken met standaard fluorescentiemicroscopen en gratis software die online beschikbaar is. waardoor de technologie goedkoop en toegankelijk is voor laboratoria over de hele wereld.

Hun publicatie, getiteld "Verbeterde superresolutie-beeldvorming met behulp van telegraafruis in organische halfgeleider-nanodeeltjes, " staat in het nummer van 14 juni van Nano-letters .