Fysisch-chemische methoden gebruiken om naar biologie op nanoschaal te kijken, een onderzoeker van het Lawrence Berkeley National Laboratory (Berkeley Lab) heeft een nieuwe technologie uitgevonden om afzonderlijke moleculen in beeld te brengen met een ongekende spectrale en ruimtelijke resolutie, wat leidde tot de eerste "true-color" superresolutiemicroscoop.

Ke Xu, een faculteitswetenschapper in de Life Sciences Division van Berkeley Lab, heeft zijn innovatie SR-STORM genoemd, of spectraal opgeloste stochastische optische reconstructiemicroscopie. Omdat SR-STORM volledige spectrale en ruimtelijke informatie geeft voor elk molecuul, de technologie opent de deur naar beeldvorming met hoge resolutie van meerdere componenten en lokale chemische omgevingen, zoals pH-variaties, binnen een cel.

Het onderzoek werd gerapporteerd in het tijdschrift Natuurmethoden in een paper getiteld, "Ultrahigh-throughput single-molecule spectroscopie en spectraal opgeloste superresolutiemicroscopie, " met co-auteurs Zhengyang Zhang, Samuël Kenny, Margaret Hauser, en Wan Li, heel UC Berkeley. Xu is ook een assistent-professor aan de afdeling Chemie van UC Berkeley.

"We meten zowel de positie als het spectrum van elk individueel molecuul, het plotten van zijn super-opgeloste ruimtelijke positie in twee dimensies en het kleuren van elk molecuul volgens zijn spectrale positie, dus in die zin het is ware-kleuren superresolutiemicroscopie, dat is de eerste in zijn soort, " zei Xu. "Dit is een nieuw type beeldvorming, het combineren van spectrale meting van één molecuul met superresolutiemicroscopie."

Bovendien, SR-STORM is een hoge doorvoer, in staat om in ongeveer vijf minuten ruimtelijke en spectrale informatie te leveren voor miljoenen afzonderlijke moleculen, vergeleken met enkele minuten voor een enkel beeldframe dat tientallen moleculen omvat met behulp van conventionele op scanning gebaseerde technieken.

Xu bouwde voort op het werk dat hij deed als postdoctoraal onderzoeker aan Harvard bij Xiaowei Zhuang, die STORM heeft uitgevonden, een superresolutiemicroscopiemethode op basis van beeldvorming met één molecuul en fotoswitching. Door een dubbel objectiefsysteem te bedenken met twee microscooplenzen tegenover elkaar, Xu en collega's bekeken tegelijkertijd de voor- en achterkant van het monster en bereikten een ongekende optische resolutie (van ongeveer 10 nanometer) van een cel. Door deze methode te gebruiken om neuronen in beeld te brengen, ze toonden aan dat actine, een belangrijk onderdeel van het cytoskelet (ruggengraat van de cel), heeft een andere structuur in axonen dan in dendrieten, twee delen van een neuron.

Maar de huidige superresolutiemicroscopietechnieken leveren geen spectrale informatie, wat nuttig is voor wetenschappers om het gedrag van individuele moleculen te begrijpen, evenals om hoogwaardige meerkleurige beeldvorming van meerdere doelen mogelijk te maken.

"Dus hebben we een systeem met twee objectieven geconstrueerd, maar het beeld met één molecuul dat door één objectieflens is verzameld, in het spectrum verspreid, terwijl het andere beeld behouden blijft voor lokalisatie van één molecuul, " zei Xu. "Nu zijn we tegelijkertijd het spectrum van de afzonderlijke moleculen aan het accumuleren en ook hun positie, dus we hebben het raadsel opgelost."

Vervolgens kleurden ze het monster met 14 verschillende kleurstoffen in een smal emissievenster en bekrachtigden en fotoschakelden ze de moleculen met één laser. Terwijl de spectra van de 14 kleurstoffen sterk overlappen omdat ze bijna uitgestoten zijn, ze ontdekten dat de spectra van de individuele moleculen verrassend verschillend waren en dus gemakkelijk te identificeren. "Dat is handig omdat het betekent dat we een manier hadden om veelkleurige beeldvorming te maken binnen een zeer smal emissievenster, ' zei Xu.

Inderdaad, vier kleurstoffen gebruiken om vier verschillende subcellulaire structuren te labelen, zoals mitochondriën en microtubuli, ze waren in staat om moleculen van verschillende kleurstoffen gemakkelijk te onderscheiden op basis van hun spectrale gemiddelde alleen, en elke subcellulaire structuur had een aparte kleur.

"Dus met deze methode kunnen we kijken naar interacties tussen vier biologische componenten in een cel in driedimensionale en met een zeer hoge resolutie van ongeveer 10 nanometer, " zei Xu. "De toepassingen liggen op dit moment voornamelijk in fundamenteel onderzoek en celbiologie, maar hopelijk leidt het tot medische toepassingen. Dit geeft ons nieuwe mogelijkheden om naar celstructuren te kijken, hoe ze zijn opgebouwd, en of er sprake is van degradatie van die structuren bij ziekten."

Veel ziekten worden veroorzaakt door een binnendringend pathogeen of door afbraak van de interne structuur van een cel. Alzheimer, bijvoorbeeld, kan verband houden met de afbraak van het cytoskelet in neuronen. "Het cytoskeletsysteem bestaat uit een groot aantal op elkaar inwerkende subcellulaire structuren en eiwitten, en onze techniek zal onderzoek mogelijk maken naar de interacties tussen deze verschillende doelen met een ongekend aantal kleurkanalen en ruimtelijke resolutie, " hij zei.

Volgende, Xu probeert de methode te verfijnen door een systeem met één doel te gebruiken, en laat het werken met conventionele microscoopsystemen, waardoor het breder toegankelijk wordt. Hij probeert ook geschikte kleurstoffen en sondes te ontwikkelen om de lokale omgeving te monitoren, zoals de pH, in levende cellen op nanometerschaal.