Kwantificeer uw RNA-monster door de absorptie van ultraviolet licht (UV) te meten. Een nano-drop spectrofotometer gebruikt slechts één of twee microliters van uw sample, die u kunt herstellen. Andere spectrofotometers vereisen een veel groter monster. De extinctiecoëfficiënt voor nucleotiden bij een UV-golflengte van 260 nm in een lichtpad van 1 cm is 20. Gebaseerd op deze extinctiecoëfficiënt is de absorptie van 40 μg /ml RNA onder dezelfde omstandigheden één. Aan de hand van deze informatie kunt u de concentratie van uw RNA-monster berekenen.

Maak een verdunning, indien nodig, van uw monster. Een standaardverdunning voor een microcuvette is 1:40. Maak deze verdunning door 2 μL RNA-monster toe te voegen aan 78 μL steriel water.

Volg de protocollen van uw specifieke spectrofotometer om de machine te kalibreren met behulp van een blanco en bepaal vervolgens de optische dichtheid van uw monster bij een UV-golflengte van 260 nm.

Vermenigvuldig de absorptie van uw monster met uw verdunningsfactor met 40 μg RNA /ml. De vergelijking zou zijn: "RNA-concentratie (μg /ml) = (OD260) x (verdunningsfactor) x (40 μg RNA /ml) /(1 OD260-eenheid)" (Hofstra.edu) Bijvoorbeeld: als u uw steekproef verdund met 1:40 en uw absorptie was 0,08, u zou 0,08 x 40 x 40 = 128 μg /ml = 0,13 μg /μL vermenigvuldigen

Bereken de zuiverheid van uw monster door een andere absorptieaflezing te nemen op 280nm UV-golflengte . De verhouding OD 260 /OD 280 geeft aan of - en op welk niveau - uw monster is verontreinigd met eiwit of fenol. Een resultaat van 1,8 tot 2,0 geeft kwaliteits-RNA aan.

Tip

Vergeet niet uw spectrofotometer te kalibreren. Als u een snelle elektroforetische gel gebruikt, worden uw spec-resultaten bevestigd.

Waarschuwing

Ga er niet van uit dat uw monster puur is. De tijd nemen voor een OD260 /OD280-verhouding bespaart tijd en geld op de weg.