Onderzoekers hebben een nieuwe microscopietechniek ontwikkeld die 3D-beelden met superresolutie van subcellulaire structuren kan verkrijgen van ongeveer 100 micron diep in biologisch weefsel, inclusief de hersenen. Door wetenschappers een dieper inzicht in de hersenen te geven, de methode zou kunnen helpen om subtiele veranderingen te onthullen die zich in de loop van de tijd in neuronen voordoen, tijdens het leren, of als gevolg van een ziekte.

De nieuwe benadering is een uitbreiding van de gestimuleerde emissiedepletie (STED) microscopie, een baanbrekende techniek die resolutie op nanoschaal bereikt door de traditionele diffractielimiet van optische microscopen te overwinnen. Stefan Hell won in 2014 de Nobelprijs voor Scheikunde voor de ontwikkeling van deze beeldvormingstechniek met superresolutie.

In optiek , beschrijven de onderzoekers hoe ze hun nieuwe STED-microscoop gebruikten om afbeeldingen te maken, in superresolutie, de 3D-structuur van dendritische stekels diep in de hersenen van een levende muis. Dendrische stekels zijn kleine uitsteeksels op de dendritische takken van neuronen, die synaptische input ontvangen van naburige neuronen. Ze spelen een cruciale rol bij neuronale activiteit.

"Onze microscoop is het eerste instrument ter wereld dat een 3D STED-superresolutie bereikt diep in een levend dier, "Zei leider van het onderzoeksteam Joerg Bewersdorf van de Yale School of Medicine. "Dergelijke vooruitgang in de technologie voor beeldvorming van diep weefsel zal onderzoekers in staat stellen om subcellulaire structuren en dynamiek in hun natuurlijke weefselomgeving direct te visualiseren, " zei Bewersdorf. "Het vermogen om cellulair gedrag op deze manier te bestuderen is van cruciaal belang voor het verkrijgen van een uitgebreid begrip van biologische fenomenen voor biomedisch onderzoek en voor farmaceutische ontwikkeling."

Dieper gaan

Conventionele STED-microscopie wordt meestal gebruikt om gekweekte celmonsters af te beelden. Het gebruik van de techniek om dik weefsel of levende dieren in beeld te brengen is een stuk uitdagender, vooral wanneer de voordelen van superresolutie van STED worden uitgebreid naar de derde dimensie voor 3D-STED. Deze beperking treedt op omdat dik en optisch dicht weefsel verhindert dat licht diep doordringt en niet goed scherpstelt, waardoor de superresolutiemogelijkheden van de STED-microscoop worden aangetast.

Om deze uitdaging te overwinnen, de onderzoekers combineerden STED-microscopie met twee-fotonexcitatie (2PE) en adaptieve optica. "2PE maakt beeldvorming dieper in het weefsel mogelijk door gebruik te maken van nabij-infrarode golflengten in plaats van zichtbaar licht, " zei Mary Grace M. Velasco, eerste auteur van het artikel. "Infrarood licht is minder vatbaar voor verstrooiing en, daarom, beter in staat is om diep in het weefsel door te dringen."

De onderzoekers voegden ook adaptieve optica toe aan hun systeem. "Het gebruik van adaptieve optica corrigeert vervormingen in de vorm van licht, d.w.z., de optische aberraties, die ontstaan ​​bij beeldvorming in en door weefsel, " zei Velasco. "Tijdens de beeldvorming, het adaptieve element wijzigt het lichtgolffront op precies de tegenovergestelde manier als het weefsel in het monster. De afwijkingen van het adaptieve element, daarom, de aberraties uit het weefsel opheffen, het creëren van ideale beeldomstandigheden waardoor de STED-superresolutiemogelijkheden in alle drie de dimensies kunnen worden hersteld."

Veranderingen in de hersenen zien

De onderzoekers testten hun 3-D-2PE-STED-techniek door eerst goed gekarakteriseerde structuren in gekweekte cellen op een dekglaasje af te beelden. In vergelijking met het gebruik van 2PE alleen, 3-D-2PE-STED loste volumes op die meer dan 10 keer kleiner zijn. Ze toonden ook aan dat hun microscoop de verdeling van DNA in de kern van huidcellen van muizen veel beter kon oplossen dan een conventionele microscoop met twee fotonen.

Na deze testen, de onderzoekers gebruikten hun 3-D-2PE-STED-microscoop om de hersenen van een levende muis in beeld te brengen. Ze zoomden in op een deel van een dendriet en losten de 3D-structuur van individuele stekels op. Vervolgens beeldden ze twee dagen later hetzelfde gebied af en toonden aan dat de structuur van de wervelkolom in die tijd inderdaad was veranderd. De onderzoekers zagen geen veranderingen in de structuur van de neuronen in hun afbeeldingen of in het gedrag van de muizen die zouden wijzen op schade door de beeldvorming. Echter, ze zijn wel van plan dit verder te bestuderen.

"Dendritische stekels zijn zo klein dat het zonder superresolutie moeilijk is om hun exacte 3D-vorm te visualiseren, laat staan ​​eventuele veranderingen in deze vorm in de loop van de tijd, " zei Velasco. "3-D-2PE-STED biedt nu de middelen om deze veranderingen waar te nemen en niet alleen in de oppervlakkige lagen van de hersenen, maar ook dieper van binnen, waar meer van de interessante verbindingen plaatsvinden."