Met een ultranauwkeurige microscoop die de beperkingen van de Nobelprijswinnende superresolutiemicroscopie overtreft, kunnen wetenschappers de afstanden tussen individuele moleculen rechtstreeks meten.

UNSW-medische onderzoekers hebben ongekende resolutiemogelijkheden bereikt in microscopie met één molecuul om interacties tussen individuele moleculen in intacte cellen te detecteren.

De Nobelprijs voor de Scheikunde van 2014 werd toegekend voor de ontwikkeling van fluorescentiemicroscopietechnologie met superresolutie die microscopistes het eerste moleculaire beeld in cellen bood, een vermogen dat nieuwe moleculaire perspectieven op complexe biologische systemen en processen heeft opgeleverd.

Nu is de detectielimiet van microscopen met één molecuul opnieuw overschreden, en de details worden gepubliceerd in het huidige nummer van wetenschappelijke vooruitgang .

Hoewel individuele moleculen al met superresolutiemicroscopie konden worden waargenomen en gevolgd, interacties tussen deze moleculen vinden plaats op een schaal die minstens vier keer kleiner is dan de schaal die wordt opgelost door bestaande microscopen met één molecuul.

"De reden waarom de lokalisatieprecisie van microscopen met één molecuul normaal gesproken ongeveer 20-30 nanometer is, is omdat de microscoop daadwerkelijk beweegt terwijl we dat signaal detecteren. Dit leidt tot onzekerheid. Met de bestaande superresolutie-instrumenten, we kunnen niet zeggen of het ene eiwit aan een ander eiwit is gebonden, omdat de afstand tussen hen korter is dan de onzekerheid van hun posities, " zegt Scientia-professor Katharina Gaus, onderzoeksteamleider en hoofd van UNSW Medicine's EMBL Australia Node in Single Molecule Science.

Om dit probleem te omzeilen, het team bouwde autonome feedbackloops in een microscoop met één molecuul die het optische pad en het podium detecteert en opnieuw uitlijnt.

"Het maakt niet uit wat je met deze microscoop doet, het vindt in principe zijn weg terug met precisie onder een nanometer. Het is een slimme microscoop. Het doet alle dingen die een operator of een servicemonteur moet doen, en dat doet hij 12 keer per seconde, ’ zegt professor Gaus.

De afstand tussen eiwitten meten

Met het ontwerp en de methoden die in het document worden beschreven, het feedbacksysteem dat is ontworpen door het UNSW-team is compatibel met bestaande microscopen en biedt maximale flexibiliteit voor monstervoorbereiding.

"Het is een heel eenvoudige en elegante oplossing voor een groot beeldvormingsprobleem. We hebben zojuist een microscoop in een microscoop gebouwd, en het enige wat het doet is de hoofdmicroscoop uitlijnen. Dat de oplossing die we hebben gevonden eenvoudig en praktisch is, is een echte kracht, omdat het systeem gemakkelijk zou kunnen worden gekloond, en snelle acceptatie van de nieuwe technologie, ’ zegt professor Gaus.

Om het nut van hun ultraprecieze feedback-microscoop met één molecuul aan te tonen, de onderzoekers gebruikten het om directe afstandsmetingen uit te voeren tussen signaaleiwitten in T-cellen. Een populaire hypothese in de cellulaire immunologie is dat deze immuuncellen in een rusttoestand blijven wanneer de T-celreceptor zich naast een ander molecuul bevindt dat als rem werkt.

Hun uiterst nauwkeurige microscoop kon aantonen dat deze twee signaalmoleculen in feite verder van elkaar gescheiden zijn in geactiveerde T-cellen, het loslaten van de rem en het inschakelen van de T-celreceptorsignalering.

"Conventionele microscopietechnieken zouden zo'n kleine verandering niet nauwkeurig kunnen meten, aangezien de afstand tussen deze signaalmoleculen in rustende T-cellen en in geactiveerde T-cellen slechts 4-7 nanometer verschilde, ’ zegt professor Gaus.

"Dit laat ook zien hoe gevoelig deze signaleringsmachines zijn voor ruimtelijke segregatie. Om dergelijke regelgevende processen te identificeren, we moeten nauwkeurige afstandsmetingen uitvoeren, en dat is wat deze microscoop mogelijk maakt. Deze resultaten illustreren het potentieel van deze technologie voor ontdekkingen die op geen enkele andere manier konden worden gedaan."

Postdoctoraal onderzoeker, Dr. Simao Pereira Coelho, samen met Ph.D. student Jongho Baek - die sindsdien zijn Ph.D. diploma - leidde het ontwerp, ontwikkeling, en het bouwen van dit systeem. Dr. Baek ontving ook de Dean's Award voor Outstanding Ph.D. Scriptie voor dit werk.