Twee-foton laser scanning microscopie beeldvorming wordt vaak toegepast om neuronale activiteit te bestuderen bij cellulaire en subcellulaire resoluties in zoogdierhersenen. Dergelijke studies zijn nog beperkt tot een enkel functioneel gebied van de hersenen. In een recent rapport, Mengke Yang en collega's van het Brain Research Instrument Innovation Center, Instituut voor Neurowetenschappen, Centrum voor Systems Neuroscience en Optical System Advanced Manufacturing Technology in China, Duitsland en het VK hebben een nieuwe techniek ontwikkeld, de multiarea two-photon real-time in vitro explorer (MATRIEX). Met de methode kon de gebruiker zich richten op meerdere regio's van het functionele brein met een gezichtsveld (FOV) van ongeveer 200 m in diameter om Ca met twee fotonen uit te voeren ²⁺ beeldvorming met eencellige resolutie tegelijkertijd in alle regio's.

Yang et al. uitgevoerde real-time functionele beeldvorming van activiteiten van één neuron in de primaire visuele cortex, primaire motorcortex en hippocampale CA1-regio tijdens verdoofde en wakkere toestanden bij muizen. De MATRIEX-techniek kan op unieke wijze meerdere microscopische FOV's configureren met behulp van een enkel laserscanapparaat. Als resultaat, de techniek kan worden geïmplementeerd als een add-on optische module binnen bestaande conventionele single-beam-scanning, twee-foton microscopen zonder aanvullende aanpassingen. De MATRIEX kan worden toegepast om neuronale activiteit in meerdere gebieden in vivo te onderzoeken voor hersenbrede neurale circuitfunctie met eencellige resolutie.

Twee-foton lasermicroscopie ontstond in de jaren negentig en werd populair onder neurowetenschappers die geïnteresseerd waren in het bestuderen van neurale structuren en functies in vivo. Een groot voordeel van beeldvorming met twee fotonen en drie fotonen voor levende hersenen is de optische resolutie die wordt bereikt over dicht gelabelde hersenweefsels die licht sterk verstrooien, waarbij optisch gesegmenteerde beeldpixels kunnen worden gescand en verkregen met minimale overspraak. Echter, de voordelen veroorzaakten ook aanzienlijke nadelen aan de methode door het gelijktijdige zicht op twee objecten binnen een bepaalde afstand te voorkomen. Onderzoekers hadden eerder veel strategieën geïmplementeerd om de limieten te verlengen, maar de methoden waren moeilijk te implementeren in onderzoekslaboratoria voor neurowetenschappen. Hoe dan ook, er bestaat in de neurowetenschappen een steeds grotere vraag naar hersenbrede neuronale functies met eencellige resolutie in vivo.

In een directe benadering, wetenschappers kunnen twee microscopen boven hetzelfde dierenbrein plaatsen om tegelijkertijd de cortex en het cerebellum in beeld te brengen. Maar dergelijke inspanningen kunnen leiden tot een aanzienlijke toename in complexiteit en kosten. De bestaande hoge verwachtingen voor prestaties en haalbaarheid vormen daarom een ​​zeer uitdagende technische vraag over hoe een enkel beeldvormingssysteem tegelijkertijd live microscopische beelden van meerdere hersengebieden in vivo kan verkrijgen. Om de vraag te beantwoorden, Yang et al. introduceerde een nieuwe methode die tweetrapsvergroting en meerassige optische koppeling combineerde.

Ze realiseerden de methode met behulp van een droog objectief met lage vergroting (DO), met meerdere in water ondergedompelde, geminiaturiseerde doelstellingen (MO's) onder de droge doelstelling. De wetenschappers plaatsten elk van de MO's op de gewenste doelpositie en diepte in het hersenweefsel. Het team gebruikte de nieuwe samengestelde objectassemblage op dezelfde manier als het oorspronkelijke in water ondergedompelde microscoopobjectief zonder aanvullende aanpassingen aan het subsysteem voor beeldscanning en acquisitie.

Het onderzoeksteam stelde eerst de samengestelde MATRIEX-doelstelling samen. Voor deze, ze vervingen het conventionele objectief voor een water-immersiemicroscoop door een op maat gemaakte samengestelde objectiefconstructie, in een twee-foton laser scanning microscoop uitgerust met een conventioneel enkelstraals raster scanning apparaat. De samengestelde assemblage bevatte meerdere MO's (geminiaturiseerde doelstellingen) die door meerdere craniotomieën werden ingebracht, waarbij de wetenschappers een 3D-geprinte plastic kamer op de schedel van het muismodel lijmden. De kamer lijnde de MO's ruwweg uit met dezelfde ruimte om de laterale positie en diepte aan te passen. Yang et al. manipuleerde de individuele MO's nauwkeurig om de objecten onder alle MO's tegelijkertijd in hetzelfde beeldvlak te bekijken.

Ze implementeerden de MATRIEX-methode met behulp van twee principes; tweetraps vergroting en meerassige koppeling. Bijvoorbeeld, met behulp van tweetraps vergroting met de droge doelstelling (DO) alleen, ze observeerden kralen van 20 µm als kleine wazige stippen terwijl ze scherpe, ronde cirkels door het samengestelde samenstel. Tijdens meerassige koppeling, de wetenschappers koppelden een enkele DO aan meerdere MO's op hetzelfde beeldvlak. Met behulp van een eenvoudige rasterscan in een enkel rechthoekig frame, het onderzoeksteam verwierf een rechthoekig beeld met meerdere cirkelvormige FOV's (Field of Views) - waarbij elke FOV overeenkwam met één MO met minimale inter-FOV-pixeloverspraak.

De wetenschappers hebben de vergroting van de numerieke apertuur (NA) gecrediteerd voor een betere resolutie met de samengestelde assemblage. De bijbehorende lenzen waren ook flexibel en op maat ontworpen voor massaproductie tegen lage kosten om experimenteel ontwerp te ondersteunen. Het belangrijkste kenmerk van MATRIEX was het vermogen om meerdere objecten tegelijk af te beelden met grote diepte-intervallen. Om dit te benadrukken, Yang et al. ontwierp verschillende MO's met diverse parameters, ze op een specifieke diepte plaatsen waar de corresponderende objectvlakken op dezelfde as zijn geconjugeerd. In praktijk, het onderzoeksteam compenseerde kleine mismatches tussen de gewenste en werkelijke objectdiepte door MO's afzonderlijk aan te passen langs elk van de z-assen.

Typisch, onder de DO (droge doelstelling) wordt de maximale laterale grootte van de doelzone beperkt door de maximale grootte van het scanveld. Bijvoorbeeld, met behulp van een DO met een vergroting van 2x en een doelzone van 12 mm in diameter, wetenschappers kunnen een volledig volwassen muizenbrein in beeld brengen. In dit onderzoek, Yang et al. tegelijkertijd de frontale associatiecortex en het cerebellum van de muis in beeld gebracht. In praktijk, een 4x-luchtobjectief was geschikt om een ​​betere resolutie te bereiken om fijne dendrietstructuren te observeren.

Als bewijs van principe, het onderzoeksteam gebruikte MATRIEX om gelijktijdig twee-foton Ca . uit te voeren ²⁺ beeldvorming van fluorescent gelabelde neuronen in de primaire visuele cortex (V1-regio), primaire motorische cortex (M1-regio) en hippocampale CA1-regio van muizen. In de configuratie van de drie MO's, de wetenschappers plaatsten twee MO's die geschikt zijn voor de V1- en M1-regio, direct boven de cortex en een MO ingevoegd in het CA1-gebied van de hippocampus na operatief verwijderen van een corticaal weefsel. Het team ontwierp vervolgens de lenzen voor de objectvlakken die overeenkomen met V1, M1 en CA1 voor conjugatie op hetzelfde beeldvlak. Met behulp van een twee-fotonenmicroscoop uitgerust met een 12 kHz resonantiescanner, de wetenschappers scanden het volledige beeld om drie FOV's en hun afzonderlijke cellen te observeren na het vergroten van de drie verschillende secties om afzonderlijke neuronen op te lossen. Vervolgens noteerden ze het laservermogen dat over meerdere FOV's moest worden verdeeld.

Terwijl Yang et al. had deze resultaten kunnen verkrijgen met behulp van conventionele single-FOV-beeldvorming binnen een enkel hersengebied, de MATRIEX-techniek leverde hen gegevens op die verder gingen dan die welke worden aangeboden met enkelvoudige FOV-beeldvormingstechnieken. Bij elkaar genomen, deze resultaten maakten een zeer inhomogene verdeling en transformatie van spontane activiteitspatronen van de verdoofde toestand naar de wakkere toestand bij muizen mogelijk, die een hersenbreed circuitniveau overspant met een resolutie van één cel.

Op deze manier, Menge Yang en collega's ontwikkelden de MATRIEX-techniek op basis van het principe van tweetrapsvergroting en meerassige optische koppeling. Ze voerden gelijktijdig twee-foton Ca . uit ²⁺ beeldvorming in neuronale populatieactiviteiten op verschillende diepten in diverse regio's (V1, M1 en CA1) in verdoofde en wakkere muizen met eencellige resolutie. belangrijk, elke conventionele twee-fotonenmicroscoop kan worden omgevormd tot een MATRIEX-microscoop, met behoud van alle originele functionaliteiten. De sleutel tot transformatie is gebaseerd op het ontwerp van een samengestelde objectieve assemblage. De onderzoekers kunnen verschillende, zorgvuldig ontworpen MO's voor verschillende hersengebieden met 100 procent compatibiliteit tussen de MATRIEX-techniek en conventionele microscopie. Het onderzoeksteam verwacht dat de MATRIEX-techniek de driedimensionale, hersenbrede neurale circuitdynamiek bij eencellige resolutie.

© 2019 Wetenschap X Netwerk