Microfluïdische systemen worden gebruikt in de moleculaire biologie, biochemie en biotechnologie om heterogene biomoleculaire mengsels snel te analyseren met hoge terugwinningspercentages en minieme monstervolumes. Echter, het is een uitdaging om voorbereidende en analytische processen te combineren binnen één apparaat voor snelle geïntegreerde analyse. In een recente studie die nu is gepubliceerd op Microsystemen en nano-engineering , Kadi L. Saar en medewerkers van de interdisciplinaire afdelingen scheikunde, natuurkunde, en Fluidic Analytics Limited in Cambridge, VK, hebben een chip ontwikkeld die de twee stappen van voorbereiding en analyse combineert.

aanvankelijk, ze gebruikten spanning om eiwitmoleculen te scheiden in een binair mengsel van biomoleculen van gelijke grootte die niet te onderscheiden zijn via conventionele meet- of oplossingstechnieken. Daarna, het onderzoeksteam gebruikte het nieuwe apparaat om een ​​2D-vingerafdruk van een heterogeen eiwitmengsel te verkrijgen. De resultaten zullen nieuwe mogelijkheden openen om op korte tijd snelle multiparametergegevens over biomoleculaire systemen te verkrijgen.

Microfluïdische technieken zijn aantrekkelijk om biologische monsters te analyseren vanwege de zeer lage monstervereisten en een hoog herstelpercentage. De platforms kunnen een onovertroffen analysesnelheid bieden op het niveau van afzonderlijke bedrijfseenheden of meerdere eenheden voorzien van een direct gecombineerde workflow, zonder monsteroverdracht tussen de eenheden. Dergelijke overdrachten vinden plaats via connectoren of buizen en introduceren dispersie in het monster, die de prestaties van het systeem beïnvloeden. De hierin voorgestelde workflow kan heterogene mengsels scheiden om de componenten van belang te bepalen en complexiteit te verminderen voor verdere verwerking van het mengsel voor de zuivering ervan.

Onderzoekers hadden eerder een verscheidenheid aan op continue stroom gebaseerde moleculaire scheidingsstrategieën op micronschaal geïntroduceerd, inclusief free-flow elektroforese, diëlektroforese, magnetoforese en akoestische scheiding. Detectiestrategieën zoals laser- of LED-geïnduceerde fluorescentie (LIF), chemiluminescentie of elektrochemische benaderingen kunnen parallel worden ingebed in dergelijke microfluïdische scheidingsplatforms. Analytische informatie over de gescheiden verbindingen kan worden verkregen met offline strategieën zoals massaspectroscopie of SDS-PAGE, maar de technieken kunnen de verwerkingssnelheid in een enkel apparaat beperken, monsterverlies of verontreiniging veroorzaken.

Saar et al. ontwikkelde daarom volledig geïntegreerde scheiding en kwantitatieve karakterisering van heterogene biomoleculaire monsters in een enkel microfluïdisch apparaat om de bestaande limieten te overwinnen door on-chip scheiding direct te koppelen aan on-chip analyse en moleculaire dimensionering. Het ontwerpkenmerk maakte de analyse van een specifieke fractie mogelijk door de toegepaste veldsterkte aan te passen. Ze ontwierpen het apparaat om gescheiden fracties te identificeren vergelijkbaar met SEC-MALS (grootte-uitsluitingschromatografie met multi-angle lichtverstrooiing) of LC (chip)-MS ((on-chip)-vloeistofchromatografie-massaspectrometrie) methoden.

Het apparaat had het extra voordeel dat het het hele proces volledig ingebakken voor elektroforetische scheiding in vrije oplossing uitvoerde, waardoor onderzoekers in een paar minuten een kwantitatieve kaart kunnen verkrijgen - veel sneller dan conventionele technieken. Het mengsel werd niet beïnvloed door het dragermedium, en de onderzoekers konden zowel zwakke als niet-covalente moleculaire interacties bestuderen.

Saar et al. ontwierp het apparaat met behulp van een native phase kwantitatieve elektroforese-eenheid die is aangesloten op een microfluïdische diffusie-apparaatafmetingseenheid (MDS). Het gecombineerde platform maakte componenten van specifieke elektroforetische mobiliteit mogelijk (µ _e1 ) voor downstream-analyse op de chip, als functie van de aangelegde elektrische veldsterkte. Ze ontwierpen drie kanalen stroomafwaarts van de elektroforese-eenheid om producten van elektrolyse weg te houden van de chip zonder het apparaat binnen te gaan. Ze minimaliseerden het aantal afzonderlijke eenheden dat de stroom in het apparaat aandreef, gekoppeld aan een stabiele werking van het apparaat voor kwantitatieve monsterkarakterisering. De wetenschappers hielden de uitlaten van de elektrolyt gescheiden van het gecombineerde apparaat om elektrische potentiaal over het apparaat toe te passen zonder een elektrische kortsluiting te veroorzaken. en om de efficiënte verwijdering van elk elektrolyseproduct mogelijk te maken zonder ophoping om drukschommelingen te voorkomen.

Het onderzoeksteam paste het elektrische potentieel toe op metalen connectoren om een ​​metalen en vloeistofinterface buiten de chip te genereren in overeenstemming met het prototype van het apparaat dat door hetzelfde team is ontworpen. In dit werk, Saar et al. ontwierp een Y-vormige stroomsplitter en hield de stromen uit elkaar totdat ze de splitter bereikten om gedeeltelijke kortsluiting te voorkomen. Ze berekenden de stroomsnelheid van de elektrolyt in het apparaat om een ​​effect te hebben op de prestaties van het apparaat.

In totaal, het microfluïdische platform met de scheidingseenheid leidde een fractie van de vloeistofstroom naar een MDS-eenheid, die het onderzoeksteam verbond met analytische SEC-MALS om de fracties te identificeren die de scheidingsmodule verlaten. Om de gegevens te analyseren en de gemiddelde molecuulgrootte voor elke fractie te verkrijgen, ze gebruikten een numerieke oplosser die het genereren van deeltjesverdelingen voorspelde. Saar et al. vergeleek de voorspelde verdelingen met experimentele gegevens en extraheerde de hydrodynamische stralen van de deeltjes in elke fractie.

Ze beeldden het mondstuk af waarop het monster het dragermedium ontmoette als een referentiepunt voor deeltjesbeweging. De wetenschappers pasten het diffusiekanaal of de stroomsnelheid aan om de analytmoleculen nauwkeurig te bepalen, ordes van grootte groter of kleiner. Sinds ze het microfluïdische platform hebben ontworpen met behulp van Poly (dimethylsiloxaan) (PDMS), de wetenschappers elimineerden elke autofluorescentie in de opstelling voordat ze de beeldgegevens analyseerden.

Vervolgens gebruikten ze het apparaat om een ​​binair mengsel van monstereiwitten te analyseren; runderserumalbumine en humaan lysozym. Om de oorspronkelijke toestand van de eiwitmoleculen te behouden, beeldden ze de labelvrije monsters af met een zelfgebouwde microscoop op basis van UV-golflengte en kwantificeerden ze de intrinsieke fluorescentie van het monster. Saar et al. bevestigde het vermogen om het mengsel in zijn componenten te scheiden door eerst een reeks spanningen toe te passen om de fluorescerende profielen te registreren. Vervolgens registreerden ze de elektroforetische mobiliteiten van de eiwitten (µ _e1 ) gecombineerd met de stroomsnelheid in het apparaat om de meeste eiwitten en hun complexen te karakteriseren. De wetenschappers veranderden de stroomsnelheid of de aangelegde spanning om biomoleculen met diverse biofysische parameters te analyseren.

Met behulp van het platform, ze karakteriseerden snel mengsels van moleculen op nanoschaal, waar individuele analyten vergelijkbare grootten vertoonden, maar verschillende elektroforetische eigenschappen. Op basis van het resulterende histogram, het onderzoeksteam bevestigde de aanwezigheid van twee verschillende monsters. Ter vergelijking, in een off-chip conventionele scheidingsbenadering, de laatste stap vereiste fractionering door monsteroverdracht van het ene analytische hulpmiddel naar het andere via onderling verbonden buizen, de prestaties van het apparaat beperken. De totale eiwitconcentratie in het onderzoek was ongeveer 100 M en de wetenschappers hebben nauwkeurig de gevoeligheidslimiet gedetecteerd tot ongeveer 100 nM, ten opzichte van de intrinsieke fluorescentie van eiwitfracties. Voor optisch niet-actieve verbindingen, Saar et al. suggereren een alternatieve detectie- en karakteriseringsstrategie, zoals droge massa-detectie.

Saar et al. gebruikte de strategie om als proof-of-concept tweedimensionale (2-D) karakteristieke kaarten van het eiwitmengsel te verkrijgen. Ze haalden kwantitatieve informatie uit de scheidingsstap en brachten de toegepaste potentialen in verband met de elektroforetische mobiliteiten van de soort om de werkzaamheid van het apparaat te schatten. Ze registreerden de stroom die in het systeem vloeide tijdens normaal bedrijf en wanneer de scheidingskamer werd kortgesloten om de totale elektrische weerstand van het apparaat en de elektroden te schatten.

De onderzoekers berekenden de elektroforetische mobiliteit als de beweging van een deeltje in een elektrisch veld voor elk van de fracties. Op basis van de experimentele gegevens, de geconstrueerde 2-D karakteristieke kaart omvatte de effectieve lading (q) en de hydrodynamische straal (Rh) van het mengsel. De resulterende elementaire ladingseenheden van de specifieke eiwitten kwamen overeen met geschatte waarden elders. Ze verkregen de volledige tweedimensionale kaart door slechts een enkel beeldvormingsframe te bewaken voor snelle analyse in oplossing.

De analytische tijd van het microfluïdische apparaat van scheiding tot diffusiemeting en beeldvorming was ongeveer 14 seconden. De wetenschappers construeerden de experimentele 2D-kaart met in totaal slechts 3 µL monster gedurende zeven minuten, ordes van grootte sneller dan de tijdschaal om conventionele 2D-eiwitgels uit te voeren. Het onderzoeksteam voerde een breed scala aan biomoleculaire interacties uit, in oplossing, direct onder inheemse omstandigheden die voorheen uitdagend waren om in het laboratorium te presteren.

Op deze manier, Kadi L. Saar en collega's ontwikkelden een microfluïdisch apparaat dat scheiding op de chip combineert met directe analyse op de chip om de bestaande conventionele benaderingen op microschaal te vervangen. Met behulp van het apparaat, ze analyseerden snel een binair mengsel van eiwitten die niet konden worden geïdentificeerd als individuele componenten via bestaande benaderingen van oplossingsgrootte. Ze construeerden een 2D-karakteristieke kaart van het heterogene mengsel op een snelle tijdschaal om de mogelijkheid van eiwitkarakterisering in oplossing te openen met een ongekende tijdresolutie in vergelijking met bestaande biofysische technieken.

© 2019 Wetenschap X Netwerk