Onderzoekers van het Moscow Institute of Physics and Technology hebben een recensie gepubliceerd over seriële femtoseconde kristallografie, een van de meest veelbelovende methoden voor het analyseren van de tertiaire structuur van eiwitten. Deze techniek is de afgelopen tien jaar snel geëvolueerd, nieuwe perspectieven openen voor het rationele ontwerp van geneesmiddelen die zich richten op eiwitten die voorheen ontoegankelijk waren voor structurele analyse. Het artikel verscheen in het tijdschrift Deskundig advies over het ontdekken van geneesmiddelen .

X-ray kristallografie

Röntgenkristallografie is een van de belangrijkste methoden voor het onthullen van de 3D-structuur van biologische macromoleculen, zoals eiwitten. Het heeft geholpen bij het bepalen van de structuur van talrijke farmacologisch belangrijke enzymen en receptoren, waardoor het ontwerp van geneesmiddelen die op deze eiwitten zijn gericht, mogelijk is.

De methode omvat het kristalliseren van een eiwit en het bestuderen ervan via röntgendiffractie. Eerst wordt het eiwit geïsoleerd en gezuiverd. Daarna droogt het oplosmiddel geleidelijk uit. Als resultaat, de moleculen waarvan de structuur wordt onderzocht, vormen kristallen, gekenmerkt door een interne orde. Door een kristal bloot te stellen aan röntgenstralen in een speciaal apparaat, onderzoekers verkrijgen een diffractiepatroon. Het bevat informatie over de posities van atomen in het kristal. Een nauwkeurige analyse van het patroon onthult de 3D-structuur van de samenstellende eiwitmoleculen.

Voor de komst van deze methode, nieuwe geneesmiddelen werden meestal empirisch gezocht:ofwel door de structuur van de moleculen te veranderen waarvan bekend is dat ze het doeleiwit beïnvloeden, of door arrays van moleculen in chemische bibliotheken te sorteren. Nu de 3D-structuren van veel doeleiwitten beschikbaar zijn, onderzoekers kunnen ze op een computerscherm bekijken en snel miljoenen verbindingen doorzoeken op zoek naar kandidaat-geneesmiddelen. Op die manier besparen ze veel tijd en geld die voorheen werden besteed aan chemische synthese en "natte" experimenten.

Röntgenkristallografie levert goede resultaten op voor kristallen die groot zijn, stal, en homogeen - dat wil zeggen, zonder onzuiverheden of structurele gebreken. Om een ​​zwak diffractiesignaal beter te detecteren, een krachtige stralingspuls nodig is, maar niet zo krachtig om het kristal te vernietigen. Bij conventionele röntgenkristallografie, een eiwitkristal wordt geroteerd in de röntgenstraal om diffractiepatronen voor verschillende ruimtelijke oriëntaties te produceren. Hiermee wordt maximale informatie over de constructie vastgelegd.

Methode voor lastige doelen

Kort nadat röntgenkristallografie opkwam, het werd duidelijk dat niet alle biologische macromoleculen kunnen worden gekristalliseerd. Sommige eiwitten worden gewoonlijk opgelost in het binnenste celmedium. Dus het is vrij eenvoudig om ze in oplossing te brengen, verdamp het, en verkrijg een groot regelmatig kristal. Maar membraaneiwitten, veel receptoren onder hen, vormen kristallen die niet groot en zuiver genoeg zijn voor standaard röntgenkristallografie. Dat gezegd hebbende, veel van deze eiwitten zijn betrokken bij de ontwikkeling van ziekten, wat betekent dat hun structuur van groot belang is voor farmacologen.

Minder dan een decennium geleden, er is een oplossing gevonden voor membraaneiwitten. Deze nieuwe techniek, seriële femtoseconde röntgenkristallografie genoemd, of SFX, vertrouwt op röntgenvrije-elektronenlasers, ontwikkeld kort voor SFX.

Alexey Misjin, plaatsvervangend hoofd van het Laboratorium voor Structurele Biologie van Receptoren bij MIPT, die co-auteur was van de studie, legde uit:"Wat het tot een baanbrekende technologie maakt, is een zeer hoge energiedichtheid van de laserpuls. Het object wordt blootgesteld aan zo'n krachtige straling dat het uit elkaar valt, onvermijdelijk en bijna onmiddellijk. Maar voordat het zover is, enkele individuele quanta van de laserpuls verstrooien van het monster en komen bij de detector terecht. Dit is het zogenaamde diffraction-before-destruction-principe om de structuur van het oorspronkelijke eiwit te bestuderen."

Röntgenlasers met vrije elektronen zijn buiten de biologie nuttig gebleken:in de afgelopen jaren SFX wordt steeds vaker gebruikt door natuur- en scheikundigen, te. Het eerste apparaat kwam in 2009 beschikbaar voor onderzoekers en nu zijn er vijf centra open voor onderzoekers in de VS, Japan, Zuid-Korea, Duitsland, en Zwitserland. Er wordt een nieuwe gebouwd in China, en de Amerikaanse faciliteit - historisch gezien de eerste - heeft plannen aangekondigd voor modernisering.

Hoewel de nieuwe technologie onderzoekers een kijkje heeft gegeven in de structuur van eiwitten die voorheen aan analyse ontsnapten, het heeft ook nieuwe technische en wiskundige oplossingen gepromoot. Conventionele röntgenkristallografie omvat het blootstellen van één kristal aan straling vanuit verschillende hoeken en het gezamenlijk analyseren van de resulterende diffractiepatronen. Bij SFX, het kristal wordt onmiddellijk vernietigd door de eerste interactie met een krachtige röntgenpuls. Dus onderzoekers moeten het proces herhalen met veel kleine kristallen en de zo gegenereerde "seriële" gegevens analyseren, vandaar de naam van de methode.

Een andere uitdaging is het selecteren van de samples voor SFX. Bij conventionele röntgenkristallografie, gewoon kiezen voor het grootste kristal van de hoogste kwaliteit was de juiste keuze. Dit kan handmatig, door de beschikbare monsters te bekijken. De nieuwe procedure vereist het werken met een suspensie van veel kleine kristallen van verschillende grootte en kwaliteit. Centrifuges en filters met bekende poriënafmetingen worden gebruikt om de kristallen op grootte te scheiden.

Methoden voor het plaatsen van monsters in de kamer moesten worden uitgewerkt, te. Röntgenlasers met vrije elektronen hebben een bepaalde maximale frequentie waarmee ze stralingspulsen kunnen uitzenden. Om de kosten en het tijdverbruik te verminderen, nieuwe kristallen moeten met dezelfde frequentie in de kamer worden gevoerd. Tot dusver, Hiervoor zijn twee benaderingen ontwikkeld. Onder de eerste, de kristallen komen de kamer binnen in een vloeibare suspensie, geleverd door een injector. De straal die de injector verlaat, wordt "geperst" door een stroom gas om een ​​correcte plaatsing van het monster te verzekeren. Dat is, bij het passeren, een kristal komt precies in het midden van de laserstraal terecht (fig. 2, links). Alternatief, de eiwitkristallen kunnen over een voor röntgenstraling transparant substraat worden verspreid en voor elke puls automatisch in de laserstraal worden gevoerd (fig. 2, Rechtsaf).

Sinds de eerste resultaten in 2011 SFX heeft meer dan 200 eiwitstructuren onthuld. Onder hen zijn 51 doelwitten die mogelijk belangrijk zijn voor de farmacologie:membraanreceptoren, fermenten, virale eiwitten, enz. - die voorheen ontoegankelijk waren voor conventionele analytische technieken.

De systematische review van de technologie zoals toegepast op biologie en farmacologie door het MIPT-team zal ongetwijfeld andere onderzoekers helpen die de structuren van belangrijke medicijndoelen willen verkrijgen om nieuwe medicijnen te ontwikkelen.