Wetenschappers van het Fred Hutchinson Cancer Research Center hebben een stap gezet om gentherapie praktischer te maken door de manier te vereenvoudigen waarop instructies voor het bewerken van genen aan cellen worden gegeven. Met behulp van een gouden nanodeeltje in plaats van een geïnactiveerd virus, ze hebben veilig hulpmiddelen voor het bewerken van genen geleverd in laboratoriummodellen van HIV en erfelijke bloedaandoeningen, zoals gemeld 27 mei in Natuurmaterialen .

Het is de eerste keer dat een gouden nanodeeltje geladen met CRISPR is gebruikt om genen te bewerken in een zeldzame maar krachtige subset van bloedstamcellen. de bron van alle bloedcellen. Het CRISPR-dragende gouden nanodeeltje leidde tot succesvolle genbewerking in bloedstamcellen zonder toxische effecten.

"Naarmate gentherapieën hun weg vinden door klinische proeven en beschikbaar komen voor patiënten, we hebben een meer praktische aanpak nodig, " zei senior auteur Dr. Jennifer Adair, een assistent-lid van de Clinical Research Division bij Fred Hutch, eraan toevoegend dat de huidige methoden voor het uitvoeren van gentherapie ontoegankelijk zijn voor miljoenen mensen over de hele wereld. "Ik wilde iets eenvoudiger vinden, iets dat passief gen-editing aan bloedstamcellen zou leveren."

Hoewel CRISPR het sneller en gemakkelijker heeft gemaakt om genetische modificaties nauwkeurig in het genoom aan te brengen, het heeft nog steeds uitdagingen. Om cellen CRISPR-tools voor het bewerken van genen te laten accepteren, is een kleine elektrische schok nodig die de cellen kan beschadigen en zelfs kan doden. En als nauwkeurige genbewerkingen nodig zijn, dan moeten er extra moleculen worden ontwikkeld om ze te leveren — wat meer kost en tijd kost.

Gouden nanodeeltjes zijn een veelbelovend alternatief omdat het oppervlak van deze kleine bolletjes (ongeveer 1 miljardste van de grootte van een korrel keukenzout) ervoor zorgt dat andere moleculen er gemakkelijk aan kunnen blijven kleven en blijven plakken.

"We hebben de gouden nanodeeltjes ontworpen om snel het celmembraan te passeren, ontwijk celorganellen die ze willen vernietigen en ga rechtstreeks naar de celkern om genen te bewerken, " zei dr. Reza Shahbazi, een postdoctoraal onderzoeker van Fred Hutch die zeven jaar met gouden nanodeeltjes heeft gewerkt voor de levering van geneesmiddelen en genen.

Shahbazi maakte de gouddeeltjes van goud van laboratoriumkwaliteit dat wordt gezuiverd en als vloeistof in een klein laboratoriumflesje wordt geleverd. Hij mengde het gezuiverde goud tot een oplossing die ervoor zorgt dat de individuele goudionen kleine deeltjes vormen, die de onderzoekers vervolgens maten voor grootte. Ze ontdekten dat een bepaalde grootte - 19 nanometer breed - het beste was om groot en plakkerig genoeg te zijn om materiaal voor het bewerken van genen aan het oppervlak van de deeltjes toe te voegen. terwijl ze nog steeds klein genoeg zijn voor cellen om ze te absorberen.

Verpakt op de gouddeeltjes, het Fred Hutch-team heeft deze componenten voor het bewerken van genen toegevoegd (diagram beschikbaar):

• Een soort moleculaire gids genaamd crRNA fungeert als een genetische GPS om het CRISPR-complex te laten zien waar in het genoom de snede moet worden gemaakt.
• CRISPR-nuclease-eiwit, vaak "genetische schaar" genoemd, " maakt de snee in het DNA. Het meest gebruikte CRISPR-nuclease-eiwit is Cas9. Maar de Fred Hutch-onderzoekers bestudeerden ook Cas12a (voorheen Cpf1) omdat Cas12a een verspringende snee in het DNA maakt. De onderzoekers hoopten dat de cellen hierdoor meer de snee efficiënt repareren en tegelijkertijd de nieuwe genetische instructies in de cel inbedden.Een ander voordeel van Cas12a ten opzichte van Cas9 is dat er slechts één moleculaire gids nodig is, wat belangrijk is vanwege de beperkte ruimte op de nanodeeltjes. Cas9 vereist twee moleculaire gidsen.
• Instructies voor welke genetische veranderingen moeten worden aangebracht ("ssDNA"). Het team van Fred Hutch koos twee erfelijke genetische veranderingen die bescherming bieden tegen ziekten:CCR5, dat beschermt tegen hiv, en gamma-hemoglobine, die beschermt tegen bloedaandoeningen zoals sikkelcelziekte en thalassemie.
• Een coating van een polyethyleenimine zwermt het oppervlak van de deeltjes om ze een positievere lading te geven, waardoor ze gemakkelijker in de cellen kunnen worden opgenomen. Dit is een verbetering ten opzichte van een andere methode om cellen genbewerkingstools te laten gebruiken, elektroporatie genoemd, wat inhoudt dat de cellen licht worden geschud om ze te openen en de genetische instructies binnen te laten.

Vervolgens isoleerden de onderzoekers bloedstamcellen met een eiwitmarker op hun oppervlak genaamd CD34. Deze CD34-positieve cellen bevatten de bloedproducerende voorlopercellen die aanleiding geven tot het gehele bloed en immuunsysteem.

"Deze cellen vullen elke dag het bloed in het lichaam aan, waardoor ze een goede kandidaat zijn voor eenmalige gentherapie omdat het een leven lang meegaat als de cellen zichzelf vervangen, ' zei Adair.

Menselijke bloedstamcellen observeren in een laboratoriumschaal, de onderzoekers ontdekten dat hun volledig geladen gouden nanodeeltjes binnen zes uur na toevoeging op natuurlijke wijze door cellen werden opgenomen en binnen 24 tot 48 uur konden ze genbewerking zien gebeuren. Ze merkten op dat de Cas12a CRISPR-eiwitpartner beter was in het leveren van zeer nauwkeurige genetische bewerkingen aan de cellen dan de meer algemeen gebruikte cas9-eiwitpartner.

Het gen-editing-effect bereikte een piek acht weken nadat de onderzoekers de cellen in muismodellen hadden geïnjecteerd; 22 weken na injectie waren de bewerkte cellen er nog steeds. De Fred Hutch-onderzoekers vonden ook bewerkte cellen in het beenmerg, milt en thymus van de muismodellen, een teken dat de delende bloedcellen in die organen de behandeling konden voortzetten zonder dat de muizen opnieuw behandeld moesten worden.

"We geloven dat we een goede kandidaat hebben voor twee ziekten - HIV en hemoglobinopathieën - hoewel we ook andere ziektedoelen evalueren waar kleine genetische veranderingen een grote impact kunnen hebben, evenals manieren om grotere genetische veranderingen aan te brengen, "Adair zei. "De volgende stap is om te vergroten hoeveel genbewerking er in elke cel plaatsvindt, wat zeker te doen is. Dat zal het dichter bij een effectieve therapie brengen."

In de studie, de onderzoekers melden dat 10 tot 20 procent van de cellen de genbewerkingen op zich nam, wat een veelbelovend begin is, maar de onderzoekers willen streven naar 50% of meer van de cellen die worden bewerkt, waarvan zij denken dat ze een goede kans hebben om deze ziekten te bestrijden.