Wetenschappers van Rice University hebben een debat over het mechanisme achter een fluorescerende biosensor die neuronen bewaakt door veranderingen in spanning waar te nemen, effectief gedoofd.

Het werk onder leiding van Rice theoretisch chemicus Peter Rossky en postdoctoraal onderzoeker Lena Simine bevestigden door middel van computersimulaties hun theorie dat een mechanisch proces de uitdoving van fluorescentie in ArcLight regelt, een synthetische spanningsindicator geplaatst in eiwitten die de binnenmembranen van neuronen bekleden.

Door hun modellen, de onderzoekers koppelden zowel het mechanisme als de fluorescentie aan de sterkte van elektrische velden die ze over de chromofoor waarnamen, het fluorescerende deel van het eiwit. Hun resultaten toonden aan dat een eenvoudige meting van het veld in een simulatie kan worden gebruikt om te voorspellen of en hoe goed nieuwe fluorescerende sensoren zich zullen gedragen voordat onderzoekers ze synthetiseren. zei Rossky.

De studie verschijnt in de Tijdschrift van de American Chemical Society .

ArcLight, ontwikkeld door Yale neurowetenschapper Vincent Pieribone in 2012, is een genetisch gecodeerd fluorescentiespanningsindicatoreiwit. Het bevat een mutatie die het fluorescentiesignaal dimt wanneer de spanning stijgt en helderder wordt wanneer de spanning daalt. Dat maakt het nuttig voor het volgen van signalen in het zenuwstelsel door het eiwit in neuronen tot expressie te brengen en te zien hoe ze oplichten.

Het eiwit is aan de celwand van het neuron vastgemaakt door een spanningsgevoelig onderdeel dat een paar angstrom beweegt wanneer een signaal van een ander neuron de elektrische lading in het membraan verandert. De Rice-onderzoekers theoretiseerden dat beweging het eiwit tegen het membraan trekt, het comprimeren en het doven van de fluorescentie.

Rossky zei dat het veranderen van de vorm van het eiwit twee residuen een nanometer dichter bij elkaar brengt. Dat is genoeg om te dicteren hoe de chromofoor energie kwijt raakt, hetzij als licht (door fotonen op te geven en te fluoresceren) of als warmte.

"We veronderstelden welke geometrieverandering in het eiwit optreedt als gevolg van de reactie van het membraan, ' zei Rossky. 'En toen vroegen we, 'Verandert dit de fluorescentie?' En we ontdekten dat dat zo is. In aanvulling, we hebben aangetoond dat het monitoren van een veel eenvoudigere kwaliteit - het elektrische veld langs twee assen waar de fluorescentie vandaan komt - voldoende is om de respons volledig te beschrijven."

ArcLight bleek een goed model te zijn. pieribot, een medewerker van Rice, vertelde aanwezigen bij een lezing in 2014 in Rice dat zelfs hij niet precies wist hoe het werkte. De lezing inspireerde Simine, die net naar Rice was gekomen, om een ​​studie van het mechanisme te beginnen.

"Ik dacht, 'Dat lijkt me een mooi project, '" ze zei.

Door samen te werken met onderzoekers in de groep van José Onuchic van Rice's Centre for Theoretical Biological Physics (CTBP) kon Simine, een chemisch fysicus van opleiding, om te profiteren van de expertise van het centrum in het simuleren van eiwitten voor het testen.

Ze zei dat een decennium lang debat tussen wetenschappers niet kon bepalen of mechanische of elektrische eigenschappen van eiwitten hun fluorescentie veroorzaakten. Het bleek een beetje van beide te zijn.

"Een recent artikel gaf computationeel bewijs dat het overwegend elektrostatisch is, en het is een beetje logisch omdat het eiwit erg zacht is, "Zei Simine. "We dachten ook dat die mutaties aan het membraan blijven plakken, en wanneer ze dat doen, de oriëntatie van het eiwit zorgt ervoor dat het eiwit kan worden gecomprimeerd." Ze ontdekte dat elektrostatische veranderingen aan het neuronale membraan de fysieke verandering veroorzaakten die fluorescentie dooft, maar liet ook een elektrisch spoor achter in het eiwit dat in de simulatie kon worden waargenomen.

"We hebben er even over nagedacht en kwamen met een reactiecoördinaat, " zei ze. "We kunnen elke mutatie van de sequentie van dit eiwit nemen en het vertalen in twee getallen die de input zijn voor dit model, de elektrostatische velden rond de chromofoor. Het is een leuke, elegante fenomenologische theorie."

Het laboratorium is van plan zijn techniek te testen op op maat gemaakte fluorescerende eiwitten en bijpassende simulaties om te zien of hun theorie en experimenten blijven aansluiten. Als ze dat doen, ze verwachten dat hun modellen zeer nuttig zullen zijn voor synthetische biologen die nieuwe klassen van fluorescerende markers maken.

"Als je de fluorescentie van een bepaald molecuul wilt weten, jij doet het experiment, ' zei Rossky. 'Maar als je wilt weten waarom het werkt, deze berekeningen zijn ongelooflijk waardevol."