Moleculaire diagnostiek speelt een steeds belangrijkere rol in de geneeskunde voor het opsporen van genetische ziekten, het monitoren van de effectiviteit van antikankertherapie, en in de strijd tegen agressieve bacteriële infecties. Nieuwsgierigheidsdiagnostiek (CD), een bedrijf dat behoort tot de Scope Fluidics-groep, heeft een nieuwe techniek voor DNA-analyse ontwikkeld:synergetische PCR (sPCR). De methode, in detail beschreven in de gezamenlijke publicatie van CD- en IPC PAS-onderzoekers in Wetenschappelijke rapporten combineert de voordelen van twee van de meest populaire genetische code-analysetechnieken van vandaag en kan worden uitgevoerd op algemeen beschikbare instrumenten.

"De DNA-assaytechniek die we voorstellen, werd geboren tijdens de ontwikkeling van het innovatieve PCR|ONE-analyse-instrument, waarmee de genetische code in slechts zeven minuten kan worden getest. Dit is een meer dan tien keer kortere tijd dan nodig is in klassieke oplossingen, " zegt prof. Piotr Garstecki (IPC PAS, CD).

Monsters die worden doorgestuurd voor DNA-assays bevatten meestal zo weinig genetisch materiaal dat analyse met conventionele laboratoriumtechnieken niet mogelijk zou zijn. Na het verwijderen van onzuiverheden uit het monster, de eerste stap is het vergroten van de hoeveelheid genetisch materiaal, vaak tot een miljard keer. Hiervoor wordt polymerasekettingreactie (PCR) gebruikt.

De PCR-reactie omvat de cyclische verwarming en koeling van een oplossing die het genetische materiaal bevat dat wordt geamplificeerd en de geschikte reagentia:een polymerase (d.w.z. het enzym dat de reactie van DNA-synthese katalyseert), de nucleotiden die nodig zijn om de DNA-streng te bouwen, en primers, d.w.z., korte DNA-fragmenten die zich kunnen hechten aan het begin en einde van het gepropageerde codefragment (bijv. een bepaald gen). Elke PCR-cyclus bestaat uit verwarmings- en koelfasen. In de eerste fase, bij een temperatuur van ongeveer 95 graden Celsius, de waterstofbruggen breken, en de tot nu toe dubbelstrengs DNA-keten splitst zich in twee enkele strengen. In de koude fase, bij een temperatuur van ongeveer 50 graden, de primers van de oplossing hechten zich aan de overeenkomstige plaatsen op de draden, waarna het polymerase er een complementaire draad tussen bouwt. Aan het einde van elke cyclus, er zijn (in ideale omstandigheden) twee keer zoveel dubbelstrengs DNA-fragmenten als in het begin.

PCR wordt gebruikt om specifieke fragmenten van de genetische code te detecteren en om de oorspronkelijke hoeveelheid genetisch materiaal te schatten. Kwantitatieve metingen worden meestal uitgevoerd met behulp van een analoge techniek die bekend staat als real-time PCR. Het monster wordt vermeerderd, en in volgende cycli, de hoeveelheid DNA wordt gecontroleerd met behulp van fluorescerende kleurstoffen. Wanneer de intensiteit van de veranderingen een ingestelde drempel overschrijdt, de oorspronkelijke hoeveelheid genetisch materiaal wordt geschat op basis van het aantal cycli. De analoge PCR-techniek is relatief eenvoudig, maar vanwege de gevoeligheid van PCR voor zelfs enkele onzuiverheden, het vereist zorgvuldigheid, continue kalibratie.

Een andere methode is digitale PCR. De steekproef is verdeeld in tien- of honderdduizenden, en soms zelfs miljoenen gelijke volumepartities. Vervolgens, in elke partitie, de procedure van duplicatie van genetisch materiaal wordt uitgevoerd en er wordt gecontroleerd of de setverandering optreedt. Tijdens de deling van het monster-DNA, moleculen bereiken slechts enkele partities, dus de verandering vindt niet overal plaats. Op basis van het aantal geregistreerde signalen kan dus de oorspronkelijke hoeveelheid DNA worden geschat. Het voordeel van digitale technologie is dat het apparaat niet gekalibreerd hoeft te worden. Echter, vanwege de noodzaak om een ​​groot aantal reacties parallel uit te voeren, de testapparatuur is duur en komt in laboratoria niet zo vaak voor als analoge PCR-apparatuur.

Synergetische PCR, de door CD en IPC PAS voorgestelde techniek, combineert de belangrijkste voordelen van de analoge en digitale methode. Om betrouwbare metingen te verkrijgen, het is voldoende om een ​​monster te verdunnen tot slechts een dozijn, of hoogstens enkele tientallen partities. Deze methode vereist geen kalibratie.

"Een klein aantal partities, kenmerkend voor onze techniek, is van specifiek praktisch belang. Het betekent dat om de analyse uit te voeren, alles wat nodig is, is het standaard well-plate-formaat dat wordt gebruikt in populaire analoge PCR-apparaten, " zegt Pawel Debski, een IPC PAS-promovendus, die de sPCR-methode ontwikkelde bij Curiosity Diagnostics.

Vanwege een klein aantal voorbeeldpartities, de sPCR-techniek is gemakkelijker uit te voeren en iets sneller dan digitale varianten. In vergelijking met analoge technieken, echter, er zijn meer reagentia nodig. Om deze reden, het zal de analoge variant niet vervangen, volgens de wetenschappers. Echter, het kan een waardevolle toevoeging zijn omdat het niet gekalibreerd hoeft te worden, waardoor het laboratoriumpersoneel zelfstandig de juistheid van analoge metingen kan controleren.

"Onze DNA-testtechniek is gepatenteerd. we willen de vrijheid benadrukken om het voor niet-commerciële doeleinden te gebruiken. En aangezien het typische, populaire genetische testapparatuur, het enige dat u hoeft te doen om aan de slag te gaan, is naar ons artikel te reiken, " benadrukt prof. Garsteki.

In standaard PCR-machines, relatief langzame warmtediffusie tussen het monster en een aangrenzend groot blok afwisselend verwarmd of gekoeld materiaal wordt gebruikt om het genetische materiaal te verwarmen en af ​​te koelen. In PCR|ONE, infraroodstraling wordt gebruikt om het monster snel te verwarmen. Het diffusiekoelmechanisme is ook aangepast:het hiervoor gebruikte blok is kleiner dan bij conventionele instrumenten en het wordt constant gehouden, strikt gecontroleerde temperatuur. Als gevolg van de technische en analytische verbeteringen, de prototypes van PCR|ONE zijn in staat om DNA-assays in minder dan een kwartier te voltooien, en de PCR zelf duurt slechts zeven minuten. De eerste PCR|ONE-apparaten zullen hoogstwaarschijnlijk over twee tot drie jaar op de markt komen.