In moleculaire biologie kan een goede bufferkeuze en voorbereiding voor verschillende DNA-isolatiestappen het verschil zijn tussen verdergaan met eiwitexpressie of het openen van een nieuwe maxi-prep kit om opnieuw te beginnen. Ondanks hun cruciale belang, zijn bufferrecepten vaak precies dat - recepten geschreven zonder uitleg of reden voor de verschillende componenten. Een dergelijke buffer is glucose-tris-EDTA of GTE-buffer.
Waar wordt GTE voor gebruikt?

GTE wordt gebruikt om bacteriële celpellets te resuspenderen voordat de cellen worden gelyseerd (opengebroken) en het plasmide-DNA wordt geoogst binnen. Lysozyme, dat de celmembranen verzacht, wordt vaak samen met de GTE-buffer toegevoegd. Het bereiken van een homogene suspensie van hele cellen tijdens deze stap, zodat de vervolgens toegevoegde lysisoplossing alle cellen kan bereiken, is de sleutel tot het verkrijgen van goede DNA-opbrengsten. GTE is ontworpen om dit te doen en tegelijkertijd een stabiele omgeving voor het DNA te bieden.
Glucose voor osmolariteit

50 mM (millimolaire) glucosesuiker wordt toegevoegd aan GTE-buffer om osmolariteit te behouden waar de concentratie opgeloste stof buiten de cellen is dichtbij dat in de cellen. Dit voorkomt voortijdige cellysis, die door aggregatie en afbraak lagere DNA-opbrengsten kan veroorzaken. De andere componenten van de buffer dragen ook bij aan de osmolariteit van de oplossing, maar glucose is een niet-elektrolyt en is een goede keuze omdat het de buffereigenschappen van de oplossing niet verstoort.
Tris voor pH-stabiliteit

Tris is de korte naam voor tris (hydroxymethyl) aminomethaan, wat een veel voorkomende pH-buffer is. In het geval van GTE-buffer wordt het zure zout (Tris-HCl) toegevoegd aan de buffer in een concentratie van 25 mM. Dit houdt de pH van de oplossing op een bijna-fysiologische 8.0, een ideale pH voor het voorkomen van zure hydrolyse (afbraak) van het plasmide-DNA en ongewenste nevenreacties van de andere celcomponenten.
EDTA voorkomt DNA-afbraak

EDTA, of ethyleendiaminetetra-azijnzuur, vangt of "cheleert" metaalionen uit de oplossing, waardoor ze niet kunnen deelnemen aan ongewenste nevenreacties. In GTE-buffer wordt EDTA toegevoegd op 10 mM. Het primaire doel is in de buffer om vrij zink, magnesium en calcium af te ronden, waardoor DNA-afbraak wordt voorkomen door bepaalde paden waarvoor die metalen nodig zijn.
Enkele belangrijke tips

Houd uw GTE-buffer koud en maak het in kleine hoeveelheden om de groei van onbedoelde bacteriën erin te voorkomen. Suiker en de gecontroleerde pH zorgen voor een geweldig groeimedium. Kraanwater kan een teveel aan metaalionen uit de leidingen bevatten, wat het vermogen van de EDTA om te vangen kan overweldigen. Als u vermoedt dat er interfererend RNA in uw monster aanwezig is, voegt u RNase A met 100 microgram per milliliter toe aan uw GTE-buffer om het probleem op te lossen.