Moleculair klonen is een veel voorkomende biotechnologische methode die elke student en onderzoeker moet kennen. Moleculair klonen met behulp van een type enzym dat een restrictie-enzym wordt genoemd om menselijk DNA in fragmenten te snijden die vervolgens in het plasmide-DNA van een bacteriecel kunnen worden ingevoegd. Restrictie-enzymen snijden dubbelstrengs DNA doormidden. Afhankelijk van het restrictie-enzym kan de snede resulteren in een plakkerig uiteinde of een stomp uiteinde. Kleverige uiteinden zijn nuttiger in moleculair klonen omdat ze ervoor zorgen dat het menselijke DNA-fragment in de juiste richting in het plasmide wordt ingebracht. Het ligatieproces, of het samensmelten van DNA-fragmenten, vereist minder DNA wanneer het DNA plakkerige uiteinden heeft. Ten slotte kunnen meerdere restrictie-enzymen met een plakkerig uiteinde hetzelfde plakkerige uiteinde produceren, hoewel elk enzym een andere restrictie-sequentie herkent. Dit verhoogt de kans dat uw DNA-regio van belang kan worden uitgesneden door plakkerige enzymen.
Beperkingsenzymen en restrictiesites

Beperkingsenzymen zijn enzymen die specifieke sequenties op dubbelstrengs DNA herkennen en knippen DNA in die volgorde in twee. De herkende volgorde wordt de restrictieplaats genoemd. Restrictie-enzymen worden endonucleasen genoemd omdat ze dubbelstrengs DNA knippen, wat normaal DNA is, op locaties die zich tussen de uiteinden van het DNA bevinden. Er zijn meer dan 90 verschillende restrictie-enzymen. Elk herkent een afzonderlijke restrictiesite. Restrictie-enzymen splitsen hun respectieve restrictieplaatsen 5000 keer efficiënter dan andere sites die ze niet herkennen.
De juiste oriëntatie

Restrictie-enzymen komen in twee algemene klassen. Ze snijden DNA in plakkerige uiteinden of stompe uiteinden. Een plakkerig uiteinde heeft een kort gebied van nucleotiden, de bouwstenen van DNA, dat ongepaard is. Dit ongepaarde gebied wordt een overstek genoemd. Van de overhang wordt gezegd dat hij plakkerig is omdat hij wil en zal paren met een ander plakkerig uiteinde dat een complementaire overhangsequentie heeft. Kleverige uiteinden zijn als lang verloren tweelingen die elkaar stevig willen omhelzen zodra ze elkaar ontmoeten. Aan de andere kant zijn stompe uiteinden niet plakkerig omdat alle nucleotiden al zijn gekoppeld tussen de twee DNA-strengen. Het voordeel van plakkerige uiteinden is dat een fragment van menselijk DNA slechts in één richting in een bacterieel plasmide past. Als daarentegen zowel het menselijke DNA als het bacteriële plasmide stompe uiteinden hebben, kan het menselijke DNA van kop tot staart of van kop tot staart in het plasmide worden ingebracht.
Liga-klevende uiteinden vereisen minder DNA

Hoewel DNA met stokuiteinden gemakkelijker door elkaar kunnen worden gevonden vanwege hun 'plakkerigheid', kunnen plakkerige uiteinden en stompe uiteinden niet samensmelten tot een continu stuk DNA. De vorming van een continu stuk DNA dat volledig is gekoppeld, vereist een enzym dat ligase wordt genoemd. Ligasen verbinden de ruggengraat van nucleotiden aan de kleverige of stompe uiteinden, resulterend in een continue keten van nucleotiden. Omdat plakkerige uiteinden elkaar sneller vinden vanwege hun aantrekking voor elkaar, vereist het proces van ligatie minder menselijk DNA en minder plasmide-DNA. De stompe uiteinden van DNA en plasmiden vinden elkaar minder snel, en daarom vereist ligatie van stompe uiteinden dat meer DNA in de reageerbuis wordt geplaatst.
Verschillende enzymen kunnen hetzelfde plakkerige einde geven

Beperking sites bevinden zich in het hele genoom van organismen, maar zijn niet gelijkmatig verdeeld. In plasmiden kunnen ze worden ontworpen om direct naast elkaar te worden geplaatst. Wetenschappers die een fragment van menselijk DNA uit het menselijke genoom willen verwijderen, moeten restrictiesites vinden die zich voor en achter het gebied van het fragment bevinden. Naast ervoor te zorgen dat een DNA-fragment in de juiste richting wordt ingebracht, kunnen verschillende enzymen met hetzelfde plakkerige uiteinde hetzelfde plakkerige uiteinde creëren, ook al herkennen ze verschillende restrictiesequenties. BamHI, BglII en Sau3A hebben bijvoorbeeld verschillende herkenningssequenties maar produceren hetzelfde GATC-plakkerige uiteinde. Dit verhoogt de waarschijnlijkheid dat er plakkerige eindbeperkingssites zullen zijn die uw menselijk gen van belang flankeren.