Onderzoek waarbij eencellige analysetechnieken en vergelijkingen met een celatlasbron werden toegepast, stelde onderzoekers van het Babraham Institute in staat om waargenomen ontwikkelingsdefecten veroorzaakt door verstoorde DNA-methylatieprocessen te koppelen aan een goed begrip van de betrokken celtypen. Dit werk, gepubliceerd in Genome Biology , bouwt voort op eerder werk dat met medewerkers is ondernomen om een ​​gedetailleerde celatlas op te stellen die het lot van de cel in kaart brengt door vroege ontwikkeling. Dit werk draagt ​​​​belangrijke nieuwe kennis bij aan het begrijpen van de rol van DNA-methylatie tijdens embryogenese, en helpt bij het ontcijferen van de regels die bepalen hoe verschillende celtypen ontstaan. Een goed begrip van deze regels is essentieel voor onderzoekers om het lot van cellen nauwkeurig en veilig te kunnen sturen om klinisch relevante celtypen voor regeneratieve geneeskunde te produceren.

Onderzoek van het Reik-labat van het Babraham Institute heeft ons begrip van de rol van DNA-methylatie tijdens de vroege stadia van ontwikkeling verbeterd. Technologische vooruitgang op dit gebied, die de mogelijkheid biedt om parallelle gegevenstypen uit een enkele cel te verzamelen en het bestaan ​​van celatlasverwijzingen en uitgebreide gegevenssets, zorgt voor een revolutie in wat we weten over de processen die het lot van cellen bepalen. Het ophelderen van de regels over hoe verschillende celtypen worden gevormd, heeft zowel toepassingen in de regeneratieve geneeskunde als bij het begrijpen van ontwikkelingsstoornissen en ziekten.

Het is bekend dat het wissen en herintroduceren van DNA-methylatie van vitaal belang is bij het vaststellen van de celidentiteit wanneer de weefsels en organen van het embryo worden gevormd. Deletie van belangrijke methyleringsenzymen bij muizen veroorzaakt in sommige gevallen ernstige ontwikkelingsstoornissen en embryonale letaliteit. Ondanks het belang van DNA-methylatie bij de ontwikkeling, zijn de onderliggende mechanismen van hoe dit wordt bereikt slecht begrepen. Dit komt door beperkingen op de informatie die onderzoekers eerder konden verzamelen om de effecten van veranderingen in de gebruikelijke processen van DNA-methylatie in ontwikkeling te begrijpen, die beperkt was tot de analyse van ontwikkelingsdefecten, monsterbeeldvorming en beperkte genoombrede analyse met behulp van bulkmonsters. Deze methoden waren niet voldoende om effecten op het niveau van verschillende celtypen op te lossen.

Met behulp van muizen waarvan de belangrijkste methyleringsenzymen waren verwijderd, voerden onderzoekers van het Reik-lab in het Epigenetics-programma van het Instituut eencellige genexpressie-analyse uit aan het begin van de orgaanontwikkeling, die plaatsvindt op dag 8.5 na de bevruchting. Door gebruik te maken van de kracht van eencellige benaderingen konden de onderzoekers volgen welke celtypes werden aangetast, in termen van niet kunnen vormen in het muizenembryo, wat de mechanismen suggereert achter de effecten die worden waargenomen op een schaal van het hele organisme.

Het onderzoek maakte gebruik van genetisch gemodificeerde muizen waarbij twee belangrijke groepen methylatie-enzymen werden verwijderd:knock-out muizenlijnen waar DNA-methyltransferasen (DNMT 1, 3a en 3b) die DNA-methylatie introduceren en handhaven afzonderlijk werden verwijderd, en een systeem om de effecten van een gecombineerde deletie van alle drie de TET-enzymen (tien-elf translocatie (TET) methylcytosine dioxygenases) 1/2/3), die demethylering veroorzaken.

Dr. Stephen Clark, een senior onderzoeker in het Reik-lab toen dit onderzoek werd uitgevoerd, zei:"Het gebruik van eencellige benaderingen biedt echt de resolutie die we nodig hebben om de mechanica van DNA-methylatie tijdens de ontwikkeling te bestuderen. Het beeld dat we konden krijgen op te bouwen bevestigt de repressieve rol van DNA-methylatie op dit ontwikkelingstijdstip, ten eerste dat het handhaven van de juiste DNA-methylatie vereist is om vroegere en alternatieve celtype-identiteiten te onderdrukken, en ten tweede dat DNA-methylatie uit delen van het genoom moet worden verwijderd om bepaalde cellen mogelijk te maken typen om te vormen."

Een techniek genaamd single-cell RNA-sequencing werd gebruikt om genexpressie over het genoom in elke muislijn te meten. Door deze expressieprofielen te vergelijken met een referentiedataset konden alle celtypen van het embryo worden geïdentificeerd. Na die stap kon het effect van verstoringen van de methylering op het lot van de cel worden beoordeeld door de samenstelling van de knock-out-embryo's (waarbij de methylatie-enzymen waren verwijderd) te vergelijken met wildtype-embryo's in hetzelfde ontwikkelingsstadium om verschillen in celtype te benadrukken. verhoudingen.

De onderzoekers waren in staat om op dag 8.5 van de ontwikkeling effecten op celtypevorming te correleren die overeenkwamen met waargenomen fenotypes en celtype-specifieke veranderingen in genexpressie te analyseren die verband konden houden met defecten in de toewijding aan het lot van de cel.

Dr. Ricard Argelaguet, een voormalig postdoctoraal onderzoeker in het Reik-lab van het Instituut en co-eerste auteur van het artikel, zei:"Het vermogen om zowel het perspectief van het hele organisme te hebben als de granulariteit van het observeren van veranderingen in celtypen en genexpressie heeft ons de mogelijkheid gegeven om de rol van DNA-methylatie en demethylatie in het zich ontwikkelende embryo op dit specifieke tijdstip uit elkaar te halen om nieuwe inzichten te creëren. Het zal even interessant zijn om deze benadering toe te passen op latere tijdstippen om meer te begrijpen over de rol van DNA-methylatie naarmate de ontwikkeling vordert."

Het onderzoek heeft een interactief gegevensplatform gecreëerd dat genexpressie-uitlezingen op eencellig niveau van Dnmt- en Tet-mutante muizenembryo's biedt.

Professor Wolf Reik, directeur van het Altos Cambridge Institute of Science, die het onderzoek leidde terwijl een groepsleider in het Epigenetica-programma van het Babraham Institute, zei:"Dit onderzoek biedt een rijke bron om het verband tussen DNA-methylatie en de oprichting van cel lot. Dit onderzoek profiteerde van gepubliceerde datasets en referentie-atlassen en we hopen dat ons werk op zijn beurt van nut is voor andere onderzoekers op zowel het gebied van ontwikkeling als epigenetica." + Verder verkennen

Nieuwe methode stimuleert onderzoek naar regulatie van genactiviteit