Het is momenteel een uitdaging om de vorming van intracellulaire nanostructuren in het laboratorium direct te observeren. In een nieuw rapport Miaomiao Zhang en een onderzoeksteam in de chemie, levenswetenschappen, medische techniek en wetenschap en technologie, in China, gebruikte een rationeel ontworpen klein molecuul, afgekort NBC-Iod-CBT (afkorting van 4-nitrobenzylcarbamaat-Cys(SEt)-Asp-Asp-Phe(jodium)-2-cyano-benzothiazol) en observeerde direct de vorming van intracellulaire nanodeeltjes met nanocomputertomografie ( nano-CT).

Tijdens de experimenten, de glutathion (GSH) reductie en nitroreductase (NTR) splitsingsmechanismen zorgden ervoor dat NBC-Iod-CBT-moleculen een klikcondensatiereactie ondergingen en zelf-assemblerende nanodeeltjes (NP's) als Iod-CBT-NP's. Toen het team nano-CT-beeldvorming uitvoerde van met NBC-Iod-CBT behandelde, nitroreductase tot expressie brengende HeLa-cellen in het laboratorium, ze toonden het bestaan ​​van zelf-geassembleerde Iod-CBT-NP's in hun cytoplasma. De nieuwe strategie is nu gepubliceerd op wetenschappelijke vooruitgang en zal biowetenschappers en bio-ingenieurs helpen de vormingsmechanismen van intracellulaire nanostructuren te begrijpen.

Een slimme strategie voor nanoassemblage

Het assembleren van nanostructuren met behulp van kleine moleculaire voorlopers in cellen is een intelligente strategie met grote voordelen bij moleculaire beeldvorming en medicijnafgifte. Kleine moleculen kunnen gemakkelijk door cellen worden opgenomen, maar ze zijn ook snel opgeruimd. In tegenstelling tot, nanostructuren met therapeutische middelen hebben langere retentietijden in cellen met een hogere potentie. Hoe dan ook, het is voor een cel veel moeilijker om een ​​nanostructuur op te nemen dan voor een klein molecuul. Wetenschappers activeren daarom nanostructuren voor cellulaire opname door het celoppervlak te modificeren met 'kernkoppen, ' maar dergelijke modificaties kunnen de reproduceerbaarheid van het nanocomplex verlagen. Als resultaat, een recent ontwikkelde slimme methode heeft tot doel intracellulaire nanodeeltjes te vormen, waar celculturen die zijn geïncubeerd met een kleine moleculaire voorloper een nanostructuur zullen hebben, voor opwindende toepassingen in moleculaire beeldvorming en medicijnafgifte. Echter, het is nog steeds moeilijk om onderscheid te maken tussen de kunstmatig gevormde nanostructuren van intrinsieke cellulaire structuren. Om dit te bereiken, Zhang et al. ontwierp eerst een jodium (jodium)-bevattende precursor voor kleine moleculen, ze onderwierpen de verbinding vervolgens aan intracellulaire, door enzymen geïnstrueerde zelfassemblage om de nanodeeltjes van belang te vormen en gebruikten nano-CT (nanocomputertomografie) om de intracellulaire nanodeeltjes te observeren.

De gejodeerde NBC-Iod-CBT kleine moleculaire structuur had een rationeel ontwerp dat uit vier delen bestond, welke bevatte

1. Een 4-nitrobenxylcarbamaat (NBC) substraat om nitroreductase (NTR) af te breken,
2. Een latent cysteïne (Cys) motief en 2-cyano-benzothiazool (CBT) structuren voor CBT-Cys klikcondensatiereacties,
3. Een gejodeerd gebied voor contrastverbetering in computertomografie, en
4. Twee hydrofiele asparaginezuurmotieven voor een goede oplosbaarheid in water onder fysiologische omstandigheden

Toen de verbinding nitroreductase (NTR) tot overexpressie brengende hypoxische (verstoken van voldoende zuurstof) kankercellen binnenging, ze ondergingen zelfassemblage om nanodeeltjes (NP's) te vormen die bekend staan ​​​​als Iod-CBT-NP's. Om de nitroreductase-(NTR)-getriggerde vorming van nanodeeltjes in het laboratorium te induceren, de wetenschappers bebroedden het kleine molecuul NBC-Iod-CBT met gebufferde zoutoplossingen en voegden de nitroreductase-oplossing gedurende twee uur toe om nanostructuren te vormen met zichtbare absorpties tussen 500-700 nm.

Wanneer Zhang et al. een nitroreductaseremmer, dicoumarine genaamd, aan de oplossing toegevoegd, de zichtbare absorptie van de mengsels nam af, bevestiging van de vorming van nanostructuren in aanwezigheid van nitroreductase. Met behulp van transmissie-elektronenmicroscopiebeelden, het team observeerde het verschijnen van nanodeeltjes en gebruikte high-performance vloeistofchromatografie (HPLC) en matrix-geassisteerde laserdesorptie/ionisatie massaspectrometrie met hoge resolutie om de vorming van Iod-CBT-NP's te bevestigen. Zhang et al. gebruikte daarna driedimensionale (3-D) nano-CT-beelden van het mengsel met een zachte röntgenmicroscopie nano-CT om uiteindelijk de 3D nano-CT-beelden te reconstrueren, waar verschillende bestanddelen van de verbinding verschillende röntgenabsorptievermogens vertoonden. Op deze manier, het experiment faciliteerde de NBC-Iod-CBT-verbinding van belang om door NTR geactiveerde zelfassemblage te ondergaan om de verwachte nanodeeltjes (Iod-CBT-NP's) in het laboratorium te vormen.

Intracellulaire vorming van Iod-CBT-NP's en zachte röntgenmicroscopie nano-CT-beeldvorming

Zhang et al. next onderzocht hetzelfde experimentele proces om zelfassemblage van nanodeeltjes in cellen te induceren. De van belang zijnde verbinding (NBC-Iod-CBT) had een hogere selectiviteit voor nitroreductase, om daarmee mogelijke intracellulaire interferenties in de aanwezigheid van andere intracellulaire bestanddelen zoals biothiolen te voorkomen, oxidanten en aminozuren. De menselijke cervicale HeLa-kankercellen brengen nitroreductase (NTR) doorgaans tot overexpressie onder hypoxische omstandigheden (zonder voldoende zuurstof), het bereiken van de hoogste experimentele niveaus binnen acht uur. Wanneer Zhang et al. geïncubeerde hypoxische HeLa-cellen met het kleine molecuul NBC-Iod-CBT, ze observeerden de uiteindelijke vorming van nanodeeltjes in de hypoxische HeLa-cellen. Met behulp van elektronenmicroscopiebeelden van de cellen, ze toonden het bestaan ​​van de nanodeeltjes zoals verwacht in het celcytoplasma.

Om de nanodeeltjes van belang (Iod-CBT-NP) in de cellen direct te observeren, het team behandelde de hypoxische HeLa-cellen experimenteel en beeldde ze af met behulp van zachte röntgenmicroscopie nano-CT. Vervolgens gebruikten ze hypoxische HeLa-cellen die waren voorbehandeld met dicoumarine of normoxia (normale zuurstofniveaus) als twee positieve controles en onbehandelde hypoxie of normoxia HeLa-cellen als twee negatieve controles. De resultaten wezen op de vorming van de Iod-CBT-nanodeeltjes in het cytoplasma van hypoxische HeLa-cellen. Toen ze deze cellen onderwierpen aan een behandeling met nitroreductaseremmers, het CT-contrast van het cytoplasma nam af. Het team reconstrueerde 2D-projecties van de cellen om 3D nanoCT-beelden te verkrijgen. Met behulp van de lineaire absorptiecoëfficiënt (LAC) of lineaire verzwakkingscoëfficiënt, Zhang et al. bevestigde de haalbaarheid van intracellulaire vorming van nanodeeltjes.

Op deze manier, Miaomiao Zhang en collega's ontwierpen rationeel een gejodeerd NBC-Iod-CBT-construct met een klein molecuul om nanodeeltjes in cellen direct te vormen en te observeren met behulp van nano-CT. Na in vitro experimenten uit de eerste hand, het team voerde verder onderzoek uit in het cytoplasma van nitroreductase tot expressie brengende HeLa-cellen. Met behulp van analytische technieken, het team toonde de vorming van nanodeeltjes (Iod-CBT-NP) in de kleine molecule NBC-Iod-CBT-behandelde hypoxische HeLa-cellen. Ze verifieerden hun methode met behulp van de lineaire absorptiecoëfficiënt en bevestigden de haalbaarheid van intracellulaire vorming van nanodeeltjes. Dit werk zal onderzoekers helpen om dieper inzicht te krijgen in de vorming van intracellulaire nanostructuren met significante toepassingen in nanogeneeskunde en bio-engineering.

© 2020 Wetenschap X Netwerk