science >> Wetenschap >  >> Biologie

DNA-sequentiebepaling: definitie, methoden, voorbeelden

Nucleotiden zijn de chemische bouwstenen van het leven en worden aangetroffen in het DNA van levende organismen. Elk nucleotide bestaat uit een suiker, fosfaat en een stikstofhoudende base: adenine (A), thymine (T), cytosine (C) en guanine (G). De specifieke volgorde van deze nucleotidebasen bepaalt welke eiwitten, enzymen en moleculen door de cel worden gesynthetiseerd.

Het bepalen van de volgorde of de volgorde van nucleotiden is belangrijk voor de studie van mutaties, evolutie, ziekteprogressie, genetisch testen, forensisch onderzoek en geneeskunde.
Genomics en DNA-sequencing

Genomics is de studie van DNA, genen, geninteracties en omgevingsinvloeden op genen. Het geheim van het ontrafelen van de complexe innerlijke werking van genen is het kunnen identificeren van hun structuur en locatie op chromosomen.

De blauwdruk van levende organismen wordt bepaald door de volgorde (of volgorde) van nucleïnezuurbaseparen in DNA. Wanneer DNA repliceert, paren adenine met thymine en cytosine met guanine; niet-overeenkomende paren worden beschouwd als mutaties
.

Sinds het dubbele helix deoxyribonucleic acid (DNA) -molecuul werd geconceptualiseerd in 1953, zijn er dramatische verbeteringen aangebracht op het gebied van genomics en grootschalige DNA-sequencing. Wetenschappers werken er hard aan om deze nieuwe kennis toe te passen op geïndividualiseerde behandeling van ziekten.

Tegelijkertijd stellen lopende discussies onderzoekers in staat de ethische implicaties van dergelijke snel exploderende technologieën voor te blijven.
Definitie van DNA-sequencing

DNA-sequencing is het proces van het ontdekken van de sequentie van verschillende nucleotidebasen in fragmenten van DNA. Whole-gen sequencing maakt vergelijking mogelijk van chromosomen en genomen van dezelfde en verschillende soorten.

Het in kaart brengen van chromosomen is nuttig voor wetenschappelijk onderzoek. Analyse van de mechanismen en structuur van genen, allelen en chromosomale mutaties in DNA-moleculen suggereert nieuwe manieren om bijvoorbeeld genetische aandoeningen te behandelen en de groei van kankertumoren te stoppen.
DNA-sequencing: Vroeg onderzoek

DNA-sequentiemethoden van Frederick Sanger vanaf het begin van de jaren zeventig sterk vooruitgegaan op het gebied van genomics. Sanger voelde zich klaar om DNA-sequencing aan te pakken na succesvol sequencing van RNA bij het bestuderen van insuline. Sanger was niet de eerste wetenschapper die zich bezighield met DNA-sequencing. Zijn slimme DNA-sequentiemethoden - ontwikkeld in samenwerking met collega's Berg en Gilbert - verdienden echter een Nobelprijs in 1980.
Sanger's grootste ambitie was het sequencen van grootschalige, hele genomen, maar sequencen van een minuscule bacteriofaag basenparen verbleekt in vergelijking met sequencing van de 3 miljard basenparen van het menselijk genoom. Desalniettemin was het leren hoe het hele genoom van een lage bacteriofaag te sequencen een belangrijke stap in de richting van het samenvoegen van het hele genoom van de mens. Omdat DNA en chromosomen bestaan uit miljoenen basenparen, scheiden de meeste sequentiemethoden DNA in kleine strengen, en vervolgens worden de DNA-segmenten aan elkaar gekoppeld; het kost gewoon tijd of snelle, geavanceerde machines.
DNA Sequencing Basics

Sanger kende de potentiële waarde van zijn werk en werkte vaak samen met andere wetenschappers die zijn interesses deelden in DNA, moleculaire biologie en life science.

Hoewel langzaam en duur in vergelijking met de huidige sequencingtechnologieën, werden de DNA-sequentiemethoden van Sanger destijds geprezen. Na vallen en opstaan vond Sanger het geheime biochemische 'recept' voor het scheiden van DNA-strengen, het creëren van meer DNA en het identificeren van de volgorde van nucleotiden in een genoom.

Hoogwaardige materialen kunnen gemakkelijk worden gekocht voor gebruik in laboratorium studies:

  • DNA-polymerase is het enzym dat nodig is om DNA te maken.
  • DNA-primer vertelt het enzym waar het aan de DNA-streng moet beginnen werken.
  • dNTP's zijn organisch moleculen bestaande uit deoxyribose suiker en nucleoside trifosfaten - dATP, dGTP, dCTP en dTTP - die eiwitten samenstellen
  • Chain-terminators zijn kleurstof-gekleurde nucleotiden, ook terminator-nucleotiden genoemd voor elke base - A, T, C en G.

    Methoden van DNA-sequencing: Sanger-methoden

    Sanger heeft ontdekt hoe hij DNA in kleine segmenten kan knippen met behulp van het enzym DNA-polymerase.

    Vervolgens maakte hij meer DNA van een sjabloon en ingevoegde radioactieve tracers in het nieuwe DNA om secties van de gescheiden strengen af te bakenen. Hij herkende ook dat het enzym een primer nodig had die kon binden aan een specifieke plek op de matrijsstreng. In 1981 schreef Sanger opnieuw geschiedenis door het genoom van de 16.000 basenparen van mitochondriaal DNA te berekenen.
    Een andere opwindende ontwikkeling was de shotgun-methode die willekeurig tot 700 basenparen in één keer bemonsterde en sequenced. Sanger is ook bekend om zijn gebruik van de dideoxy (dideoxynucleotide) methode die een DNA-eindigende nucleotide invoegt tijdens DNA-synthese om delen van DNA te markeren voor analyse. br> DNA-sequentiestappen

    De temperatuur moet tijdens het hele sequencingproces zorgvuldig worden aangepast. Eerst worden chemicaliën aan een buis toegevoegd en verwarmd om het dubbelstrengige DNA-molecuul te ontrafelen (denatureren). Vervolgens wordt de temperatuur afgekoeld, waardoor de primer kan binden.

    Vervolgens wordt de temperatuur verhoogd om optimale DNA-polymerase (enzym) activiteit te stimuleren.

    Polymerase gebruikt meestal de beschikbare normale nucleotiden, die toegevoegd in een hogere concentratie. Wanneer polymerase bij een "ketenbeëindigende" kleurstofgekoppelde nucleotide komt, stopt de polymerase en eindigt de keten daar, wat verklaart waarom de geverfde nucleotiden "kettingbeëindigende" of "terminators" worden genoemd.

    Het proces gaat verder vele, vele keren. Uiteindelijk is het kleurstofgebonden nucleotide op elke afzonderlijke positie van de DNA-sequentie geplaatst. Gelelektroforese en computerprogramma's kunnen vervolgens de kleurstofkleuren op elk van de DNA-strengen identificeren en de volledige DNA-reeks bepalen op basis van de kleurstof, de positie van de kleurstof en de lengte van de strengen.
    Advances in DNA Sequencing Technology

    Sequentiebepaling met hoge doorvoer - in het algemeen sequentiebepaling van de volgende generatie genoemd - maakt gebruik van nieuwe ontwikkelingen en technologieën om nucleotidebasen sneller en goedkoper dan ooit tevoren te sequencen. Een DNA-sequencing-machine kan gemakkelijk grootschalige stukken DNA aan. In feite kunnen de volledige genomen in een kwestie van uren worden gedaan, in plaats van jaren met de sequentietechnieken van Sanger.

    Volgende-generatie sequentiemethoden kunnen grootschalige DNA-analyse aan zonder de toegevoegde stap van amplificatie of klonen om krijg genoeg DNA voor sequencing. DNA-sequencing-machines voeren meerdere sequencing-reacties tegelijkertijd uit, wat goedkoper en sneller is.

    De nieuwe DNA-sequencing-technologie voert in wezen honderden Sanger-reacties uit op een kleine, gemakkelijk leesbare microchip die vervolgens door een computer loopt programma dat de volgorde samenstelt.

    De techniek leest kortere DNA-fragmenten, maar het is nog steeds sneller en efficiënter dan de sequentiemethoden van Sanger, dus zelfs grootschalige projecten kunnen snel worden voltooid.
    Het Human Genome Project

    Het Human Genome Project, voltooid in 2003, is een van de beroemdste sequentiestudies die tot nu toe zijn gedaan. Volgens een artikel in 2018 in Science News
    , bestaat het menselijke genoom uit ongeveer 46.831 genen, wat een formidabele uitdaging voor de sequentie was. Topwetenschappers van over de hele wereld hebben bijna 10 jaar aan samenwerking en advies gewerkt. Geleid door het National Human Genome Research

    Instituut, heeft het project met succes het menselijk genoom in kaart gebracht met behulp van een samengesteld monster genomen van anonieme bloeddonoren.

    Het Human Genome Project vertrouwde op bacterieel kunstmatig chromosoom (BAC -gebaseerde) sequentiemethoden om baseparen in kaart te brengen. De techniek gebruikte bacteriën om DNA-fragmenten te klonen, wat resulteerde in grote hoeveelheden DNA voor sequencing. De klonen werden vervolgens verkleind, in een sequentiemachine geplaatst en geassembleerd in stukken die menselijk DNA vertegenwoordigen.
    Andere DNA-sequentievoorbeelden

    Nieuwe ontdekkingen in genomics veranderen de benaderingen van ziektepreventie, detectie en behandeling. De overheid heeft miljarden dollars toegezegd aan DNA-onderzoek. Wetshandhaving vertrouwt op DNA-analyse om gevallen op te lossen. DNA-testkits kunnen worden gekocht voor thuisgebruik om voorouders te onderzoeken en genvarianten te identificeren die gezondheidsrisico's kunnen inhouden:

  • Genomische analyse houdt in dat de genoomsequenties van veel verschillende soorten in de domeinen en koninkrijken van verschillende soorten worden vergeleken en vergeleken. leven. DNA-sequencing kan genetische patronen onthullen die nieuw licht werpen op wanneer bepaalde sequenties evolutionair werden geïntroduceerd. Voorouders en migratie kunnen worden opgespoord via DNA-analyse en worden vergeleken met historische gegevens.


  • De vooruitgang in de geneeskunde verloopt exponentieel, omdat vrijwel elke menselijke ziekte een genetische component heeft. DNA-sequencing helpt wetenschappers en artsen te begrijpen hoe meerdere genen met elkaar en de omgeving omgaan. Door snel het DNA van een nieuwe microbe te bepalen die een ziekte-uitbraak veroorzaakt, kunnen effectieve medicijnen en vaccins worden geïdentificeerd voordat het probleem een ernstig volksgezondheidsprobleem wordt. Genvarianten in kankercellen en tumoren kunnen worden gesequenced en worden gebruikt om geïndividualiseerde gentherapieën te ontwikkelen.


  • Forensische wetenschapstoepassingen zijn gebruikt om rechtshandhavingsinstanties te helpen duizenden moeilijke gevallen te kraken sinds het einde van de jaren tachtig volgens het National Institute of Justice. Bewijs van een plaats delict kan DNA-monsters bevatten uit bot-, haar- of lichaamsweefsel die kunnen worden vergeleken met het DNA-profiel van een verdachte om schuld of onschuld te helpen bepalen. De polymerasekettingreactie (PCR) is een veelgebruikte methode om kopieën van DNA te maken van sporenmateriaal voorafgaand aan sequencing.


  • Sequencing van nieuw ontdekte soorten kan helpen identificeren welke andere soorten het meest verwant zijn en onthullen informatie over evolutie. Taxonomen gebruiken DNA-barcodes om organismen te classificeren. Volgens de Universiteit van Georgia in mei 2018 zijn er naar schatting 303 soorten zoogdieren die nog moeten worden ontdekt.


  • Genetische tests voor ziekten zoeken naar gemuteerde genvarianten. De meeste zijn single nucleotide polymorphisms (SNP's), wat betekent dat slechts één nucleotide in de reeks is veranderd van de "normale" versie. Omgevingsfactoren en levensstijl beïnvloeden hoe en of bepaalde genen tot expressie worden gebracht. Wereldwijde bedrijven stellen geavanceerde nieuwe generatie sequencing-technologieën ter beschikking van onderzoekers over de hele wereld die geïnteresseerd zijn in multigene interacties en hele-genoom sequencing.


  • Genealogie DNA-kits gebruiken DNA-sequenties in hun database om te controleren voor varianten in de genen van een individu. De kit vereist een speekselmonster of wangstaafje dat voor analyse naar een commercieel laboratorium wordt verzonden. Naast informatie over de voorouders kunnen sommige kits afzonderlijke nucleotide polymorfismen (SNP's) of andere bekende genetische varianten zoals de BRCA1- en BRCA2-genen identificeren die worden geassocieerd met een verhoogd risico op vrouwelijke borst- en eierstokkanker.

    Ethische implicaties van DNA-sequentiebepaling

    Nieuwe technologieën hebben vaak de mogelijkheid van sociaal voordeel, maar ook schade; voorbeelden hiervan zijn slecht functionerende kerncentrales en massavernietigingswapens. DNA-technologieën brengen ook risico's met zich mee.

    Emotionele zorgen over DNA-sequencing en gen-editing tools zoals CRISPR omvatten de vrees dat de technologie het klonen van mensen mogelijk zou kunnen maken, of zou kunnen leiden tot mutante transgene dieren gecreëerd door een schurkenwetenschapper. >

    Ethische kwesties in verband met DNA-sequencing hebben vaker te maken met geïnformeerde toestemming. Gemakkelijke toegang tot direct-to-consumer DNA-testen betekent dat consumenten mogelijk niet volledig begrijpen hoe hun genetische informatie zal worden gebruikt, opgeslagen en gedeeld. Leken zijn mogelijk niet emotioneel klaar om te leren over hun defecte genvarianten en gezondheidsrisico's.

    Derden zoals werkgevers en verzekeringsmaatschappijen kunnen mogelijk personen discrimineren die defecte genen dragen die aanleiding kunnen geven tot ernstige medische problemen.

    • Meer >

    Meer >

    Hoofdlijnen

    1. Ideeën voor de dingen Kinderen kunnen met een microscoop bekijken

      Kinderen zijn vaak nieuwsgierig naar de wereld om hen heen. Een manier om deze nieuwsgierigheid aan te moedigen, is om ze een manier te bieden om de natuur op een nieuwe en intensiev

    2. Waarom is het zo moeilijk voor soorten om hun ecologische niche te verlaten?
    3. Een konijn ontleden
    4. Waarom lopen mensen meestal in dezelfde richting?
    5. Wat breekt een dubbele DNA-helix uiteen?
    6. Voelen planten pijn?
    7. Zijn er verschillen tussen mannelijke en vrouwelijke pesters?
    8. Het verschil tussen hoe interne en externe regulatoren werken
    9. Afbraak in het Noordpoolgebied

    Wetenschap

    • Wetenschap © https://nl.scienceaq.com