Nematocysten zijn prikkelende organellen van neteldieren die opmerkelijke mechanische eigenschappen hebben om 50 procent volumeveranderingen te ondergaan tijdens explosieve exocytose (proces waarbij cellen afval en grote moleculen uitscheiden), terwijl het bestand is tegen een osmotische druk van meer dan 100 bar. Onderzoekers hadden onlangs twee nieuwe eiwitcomponenten geïdentificeerd die de nematocystwand in Hydra hebben opgebouwd, waaronder (1) een cnidarian proline-rijk eiwit-1 (CPP-1) met een rigide polyproline-motief, en (2) een elastische Cnidoin met een zijdeachtig domein. In een nieuwe studie, nu verder Wetenschappelijke rapporten , Theresa Bentele en een team van onderzoekers van de departementen Geneeskunde, Moleculaire Evolutie en Genomica en het Instituut voor Fysische Chemie in Duitsland, Australië en Japan, tot expressie gebrachte recombinante Cnidoïne- en CPP-1-eiwitten in Escherichia coli .

Ze vergeleken de elasticiteitsmodulus van spontaan verknoopte bulkeiwitten met die van geïsoleerde nematocysten. De onderzoekers optimaliseerden systematisch de fabricage van uniforme eiwit-nanovezels met behulp van elektrospinning en preparatieve omstandigheden. Beide vezels bleven stabiel, zelfs na grondig wassen en onderdompelen in bulkwater, door gelijktijdige verknoping van cysteïnerijke domeinen. De resulterende nanovezels waren duidelijk verschillend van andere eiwit-nanovezels die onstabiel waren zonder chemische crosslinker-procedures. Na kwantitatieve beoordeling van mechanische eigenschappen, ze onderzochten toepassingen van Cnidoin en CPP-1 nanovezels om de groei van menselijke mesenchymale stamcellen te bevorderen.

Hydra-nematocysten omvatten vier varianten die zich ontwikkelen in de lichaamskolom van poliepen in gespecialiseerde cellen die bekend staan ​​als nematocyten. De uitstekende mechanische taaiheid van de capsulewandstructuur maakt nematocysten uniek om bio-geïnspireerde materialen in het laboratorium te vormen. De capsule bevat eiwitcomplexen die zijn verknoopt door intermoleculaire disulfidebindingen tussen cysteïnerijke domeinen (CRD), die kan worden gebruikt als een veelzijdige crosslinker om lineaire of vertakte polymeren tussen verschillende eiwitten te creëren. De wetenschappers hadden al twee nieuwe capsule-eiwitten geïdentificeerd, waaronder CPP-1 en Cnidoin, terwijl ze Hydra-nematocysten in hun vorige werk bestudeerden. Het potentieel om elastische Cnidoïne en stijve CPP-1-eiwitten te combineren, was een veelbelovende strategie om nieuwe biomaterialen te ontwerpen die stabiele structuren kunnen vormen met spontane verknoping om uitstekende flexibiliteit en taaiheid te realiseren, vergelijkbaar met biologische nematocystcapsules. Synthetische bio-geïnspireerde eiwit-nanovezels hebben steeds meer aandacht gekregen als een kunstmatige matrix voor het kweken van stamcellen voor tissue engineering-toepassingen. Electrospinning biedt een veelgebruikte methode om dergelijke vezels te fabriceren met behulp van zijde-eiwitten, collageen en gelatine. De dunne vezelproducten hebben meerdere toepassingen in wondgenezing en tissue engineering.

In het huidige werk, Bentele et al. introduceerde een nieuwe klasse synthetische crosslinker-vrije nanovezels op basis van de Hydra-nematocyst-eiwitten CPP-1 en Cnidoin met behulp van elektrospinning. Op basis van de spontane verknopingscapaciteit van CRD's hebben ze systematisch de voorbereidende omstandigheden geoptimaliseerd om crosslinker-vrije eiwit-nanovezels te ontwikkelen die stabiel zijn onder water met mogelijke toepassingen voor menselijke stamcelkweek. Het onderzoeksteam verkreeg representatieve immunofluorescentiebeelden van een Hydra geconjugeerd met CPP-1 (groen) en Cnidoin (rood) antilichamen om de eiwitten in de capsulewand te co-lokaliseren. De afbeeldingen gaven de aanwezigheid van Cnidoïne aan als dichter opeengepakt in volwassen nematocystwanden in vergelijking met CPP-1. Daarna, Bentele et al. gebruikte Western-blot-methoden om de geïsoleerde natieve nematocystcapsules en recombinante eiwitten (eiwitten tot expressie gebracht in andere organismen) te identificeren; die ze produceerden in E. coli. De resultaten wezen op aanzienlijke post-translationele modificaties van CPP-1 in Hydra. Ze bevestigden de resultaten met behulp van het CPP-1-eiwit zoals uitgedrukt in E. coli en concludeerden dat zowel CPP-1 als Cnidoïne structurele eiwitten zijn van de nematocystwand die tijdens de vorming of morfogenese is geïntegreerd.

De onderzoekers testten vervolgens de mechanische eigenschappen van Hydra-nematocysten en bulkeiwitten met behulp van scanning-elektronenmicroscopie (SEM) en atomaire krachtmicroscopie (AFM). De wetenschappers extraheren de verdeling van de elastische moduli en maten verder de elasticiteit van gezuiverd recombinant CPP-1 (reCPP-1) en Cnidoïne (reCnidoin) uitgedrukt in E. coli. Vervolgens optimaliseerden ze de productie van nanovezels door polyethyleenglycol (PEG) 900 kDa toe te voegen aan de pure oplossing om een ​​hogere viscositeit van het product te verkrijgen. Het team onderzocht de invloed van relatieve vochtigheid, die de kwaliteit van nanovezels aanzienlijk beïnvloedde, terwijl de ionsterkte of geleidbaarheid van spinoplossingen geen invloed had op de nanovezels.

Op basis van de voorlopige resultaten van materiaalontwikkeling en karakterisering, Bentele et al. gefabriceerde eiwit-nanovezels door de eiwit-PEG-oplossing op glazen dekglaasjes te elektrospinnen. De vers gesponnen recCPP-1-PEG-nanovezels vertoonden een uniforme breedte en hoogte over een 50 x 50 µm ² gebied en vertoonden een uniforme elasticiteitsmodulus. Het team heeft vervolgens de oppervlaktetopografie gemeten, een elasticiteitskaart en een karakteristieke kracht-indentatiecurve verkregen voor reCPP-1 en reCnidoin nanovezels (a) in lucht, (b) in de lucht na wassen met water, en in (c) fysiologische bufferoplossing. Ze konden PEG verwijderen door te wassen met water om een ​​significant verminderde vezeldikte voor reCnidoin-nanovezels te verkrijgen, hoewel de afmetingen minder uitgesproken waren in vergelijking met reCPP-1 na waterbehandeling.

Echter, de vezels losten niet volledig op na wassen met water en behielden hun elastische moduli. De resultaten suggereren dat de twee recombinante eiwitten stabiele nanovezels kunnen vormen door spontaan disulfidebindingen te vormen tussen CRD-uiteinden (cysteïnerijk domein). De recombinante Hydra-nematocyst-eiwitten die in dit werk werden geproduceerd, vormden ook uniforme en stabiele nanovezels door natuurlijk voorkomende CRD's in de lucht en in fysiologische buffer. Het team onderzocht de toepassingen van deze nanovezels met stabiele menselijke mesenchymale stamcelcultuur gedurende 20 dagen incubatie, waarin ongeveer 95 procent van de cellen celgroei en levensvatbaarheid vertoonde op de nieuwe bio-geïnspireerde materialen.

Op deze manier, Theresa Bentele en collega's stelden een nieuw synthetisch, crosslinkervrij biomateriaal voor nanovezels voor, bio-geïnspireerd door de nematocyst capsule-eiwitten van Hydra. Ze brachten recombinante eiwitten tot expressie van twee recent geïdentificeerde CPP-1- en Cnidoin-nematocystcapsule-eiwitten in E. coli en bereidden nanovezels via elektrospinning. Als gevolg van de cysteïnerijke domeinen (CRD), de electrospun vezels konden spontaan crosslinken via disulfidebindingen. De recombinante eiwitten reCPP-1 en reCnidoin vormden uniforme nanovezels die direct na elektrospinnen stabiel waren in water. De nieuwe materiaalconstructies demonstreerden potentieel als biocompatibele materialen, geïnspireerd op de taaie en elastische Hydra-nematocyststructuur.

© 2019 Wetenschap X Netwerk