Therapeutische eiwitten zijn op eiwitten gebaseerde kandidaat-geneesmiddelen die in het laboratorium zijn ontwikkeld voor farmaceutische en klinische toepassingen. Op basis van hun farmacokinetiek, de kandidaten kunnen worden onderverdeeld in groepen die (1) een defect of abnormaal eiwit vervangen, (2) een bestaand pad in vivo vergroten, (3) zorgen voor een nieuwe functie of activiteit in vivo, (4) interfereren met activiteiten van een molecuul of organisme en (5) leveren ingekapselde eiwitten of verbindingen, waaronder, cytotoxische medicijnen, radionuclide- of effectoreiwitten.

In een recente studie gepubliceerd in Microsystemen en nano-engineering , Travis W. Murphy en medewerkers van de afdelingen Chemische en Biologische Systeemtechniek van Virginia Tech ontwikkelden een kosteneffectieve, point-of-care synthetisch en zuiveringsplatform voor eiwittechnologie. Ze bouwden een geïntegreerd microfluïdica "Therapeutics-on-a-Chip (TOC)" -apparaat voor celvrije, therapeutische eiwitsynthese en therapeutische eiwitzuivering in een enkele opstelling.

Het vermogen om therapeutische eiwitten te synthetiseren in een point-of-care setting, kan de kosten van opslag en transport tijdens wereldwijde distributie in arme regio's snel verlagen en bijdragen aan het concept van zuinige wetenschap. De meeste eiwitten worden momenteel geproduceerd met behulp van celkweeksystemen zoals de recombinante Escherichia coli, gist, zoogdiercellen en plantencellen voor grootschalige productie, waarna ze wereldwijd worden gedistribueerd vanuit gecentraliseerde gieterijen. Echter, de beperkte halfwaardetijd van deze synthetische eiwitten vereist opslag- en verzendingsfaciliteiten bij lage temperatuur die een uitdaging zijn voor patiënten die in afgelegen en arme regio's wonen.

In het huidige werk, Murphy et al. demonstreerde eerst de werkingsprincipes van het apparaat door een reportereiwit tot expressie te brengen en te zuiveren - groen fluorescerend eiwit. Gevolgd door het gebruik van TOC om cecropine B te produceren - een antimicrobieel peptide dat veel wordt gebruikt om biofilmziekten te beheersen. De wetenschappers hebben met succes cecropine B gesynthetiseerd en gezuiverd om in zes uur een concentratie van 63 ng/µL te produceren. met een zuiverheid van 92 procent, gevolgd door het bevestigen van de antimicrobiële eigenschappen ervan met een groeiremmingstest. De TOC-technologie biedt een nieuw platform voor point-of-care eiwitsynthese en zuivering voor toegankelijke klinische therapieën.

De state-of-the-art apparaten die momenteel in gebruik zijn voor point-of-use eiwitsynthese, omvatten een systeem ter grootte van een koelkast dat een productie-zuiveringscyclus van twee dagen overspant om 800 doses van een medicijn per dag te produceren. Toch zijn de kapitaalkosten die met een dergelijk systeem gepaard gaan niet haalbaar in ontwikkelingslanden, waar de behoefte aan snelle productie van massatherapie voor distributie zwaarder weegt dan massatherapie voor langdurige opslag. In het TOC-systeem ontwikkeld door Murphy et al. de wetenschappers bereikten point-of-care-synthese en zuivering van therapeutische eiwitten met behulp van een celvrij eiwitsyntheseproces (CFPS). In dit systeem, recombinante eiwitten werden tot expressie gebracht zonder het gebruik van levende cellen, geschikt voor point-of-care productie, waar gevriesdroogde uitgangsmaterialen stabiel konden blijven tijdens opslag over een breed temperatuurbereik.

Van de eiwitten die in het onderzoek werden onderzocht, cecropin B heeft een minimale remmende concentratie van 9,5 ng/µL om antimicrobiële effecten uit te oefenen. Met behulp van de microfluïdische setup, de wetenschappers combineerden eiwitsynthese en zuivering om een ​​antimicrobieel peptide cecropin B te produceren in een klinisch relevante dosis (63 ng/µL). De continustroomproductie in de opstelling is in drie ontwikkelingsfasen voltooid:

1. Celvrij eiwitsynthese (CFPS) reactorontwerp
2. Zuiveringsreactor (P) ontwerp
3. Geïntegreerd CFPS+P-systeemontwerp

Murphy et al. gebruikte op zachte lithografie gebaseerde polydimethylsiloxaan (PMDS) gieten om de apparaten te fabriceren; het bouwen van meerlagen met behulp van micromechanische kleppen.

Tijdens de eerste fase van het ontwerp van het apparaat in de CFPS-reactor, de wetenschappers fabriceerden een microfluïdische microfluïdische chip, vergelijkbaar met eerdere studies voor on-chip eiwitsynthese. Het microfluïdische apparaat bevatte inlaten die waren verbonden met een spuitpomp die op de verwarmingsfase van een microscoop was geplaatst, waar drie inlaten (1) cellysaat ontvingen, (2) CFPS-reactiebuffer en een (3) DNA-matrijs in het lange serpentinekanaal (ongeveer 130 cm) met één uitlaat. De wetenschappers voerden de drie reactiecomponenten met een gecombineerde stroomsnelheid van 0,15 µL/min aangedreven door een spuitpomp voor een verblijftijd van 1,5 uur. Ze verwarmden de reactor met een trapverwarmer (37 graden C) en modelleerden de opstelling met behulp van COMSOL Multiphysics-software om de mechanica van het apparaat te verifiëren, voor optimale menging en reactie op basis van diffusie op de chip. Om de werkingsprincipes van het apparaat te valideren, Murphy et al. het reportereiwit gesynthetiseerd, GFP met behulp van een verscheidenheid aan DNA-sjablonen. Het systeem produceerde hoeveelheden eiwit bij een constante reactietijd.

In de tweede fase, Murphy et al. ontwierp een microfluïdisch apparaat voor eiwitzuivering op basis van een zeer efficiënt adsorptie- en wasprotocol, zoals eerder door hetzelfde onderzoeksteam werd aangetoond. Ze bedienden het apparaat met behulp van magneetventielen om de enkele micromechanische klep en bijbehorende oscillerende drukpulsen te regelen om eiwitzuivering in vier belangrijke stappen uit te voeren.

In de werkstroom, stappen waren (1) bead laden, (2) eiwitadsorptie, (3) wassen en (4) elutie. Om het proces te optimaliseren, de wetenschappers verdeelden de methode in drie verschillende workflows. Murphy et al. varieerde vervolgens de omstandigheden die de resultaten van eiwitzuivering beïnvloeden om een ​​productzuiverheid van maar liefst 98,5 procent te bereiken, met een opbrengst van 54,6 procent van het product, beter presteren dan andere methoden.

In fase drie, de wetenschappers ontwikkelden een geïntegreerd microfluïdisch platform met celvrije eiwitsynthese en -zuivering (CFPS+P) voor automatisering. Ze combineerden een continue stroomreactor en een batchzuiveringsapparaat, hoewel de twee processen om te beginnen niet intrinsiek compatibel met elkaar waren. Om voldoende compatibiliteit te bereiken, ze koppelden de twee processen aan elkaar met behulp van een buisreservoir dat het continu geproduceerde eiwit op een chip opsloeg, voorafgaand aan de zuivering. Alle apparaten die in de studie werden gebruikt om het microfluïdische systeem te bedienen, zouden mogelijk de grootte van een koffer kunnen hebben, waardoor het een zeer draagbare, therapeutisch eiwitproductiesysteem.

In totaal, de volledig geïntegreerde CFPS+P-chip bevatte vijf belangrijke stappen, waaronder:primen, eiwitsynthese, eiwit adsorptie, wassen en elutie. In een zesde stap, de wetenschappers regelden kraal verfrissend. Murphy et al. gebruikte het serpentine synthesekanaal als de individuele synthesemodule, nadat ze de gewenste hoeveelheid eiwit hebben gesynthetiseerd, ze sluiten de opstelling van de zuiveringsmodule af om het daaropvolgende zuiveringsproces te starten. Om de workflow van de installatie te testen, de wetenschappers gebruikten GFP en bereikten een zuiverheid van 98 procent.

Na CFPS+P-workflowoptimalisatie met GFP, de wetenschappers gebruikten dezelfde opstelling om de omstandigheden te optimaliseren om cecropine B te synthetiseren. Door de stappen van expressie te volgen, zuivering, elektroforese en kleuring in de opstelling, Murphy et al. bevestigde de succesvolle productie en zuivering van cecropin B en herstelde oplosbare eiwitten om 63 ng/µL te elueren, met een zuiverheid van 92 procent. Vervolgens testten ze de biologische activiteit van cecropin B ten opzichte van E coli remming om succesvolle antibiotische activiteit aan te tonen door bacteriegroei te remmen.

Op deze manier, therapeutische eiwitten die zijn gesynthetiseerd en gezuiverd met behulp van de microfluïdische opstelling, vertoonden actieve en effectieve onderdrukking van bacteriegroei. Het kosteneffectieve systeem kan actief worden geïntegreerd in omgevingen met weinig middelen voor zuinige wetenschap. Murphy et al. zijn van plan om het systeem in de toekomst volledig te automatiseren op basis van voortdurende optimalisaties. Ze voorzien toepassingen van de opstelling om een ​​reeks diverse therapeutische eiwitten te ontwikkelen voor kosteneffectieve point-of-care-productie.

© 2019 Wetenschap X Netwerk