Mitochondriën zijn dynamisch, bio-energetische intracellulaire organellen, verantwoordelijk voor energieproductie via ATP-productie tijdens ademhaling. Ze zijn betrokken bij belangrijke cellulaire metabolische taken die vitale fysiologische reacties van cellen reguleren, inclusief celsignalering, celdifferentiatie en celdood. Defecte mitochondriën zijn gekoppeld aan verschillende kritieke menselijke genetische ziekten, waaronder neurodegeneratieve aandoeningen, kanker en hart- en vaatziekten.

De gedetailleerde karakterisering van functionele mitochondriën blijft relatief onontgonnen vanwege een gebrek aan effectieve organelextractiemethoden. Bijvoorbeeld, het extractieproces moet voldoende functionaliteit van de organel ex vivo ondersteunen om hun cytosolische functies te verlichten in de aanwezigheid van cytoskelet en andere subcellulaire organellen. Omdat mitochondriën in een complex reticulair netwerk in cellen groeien om structurele veranderingen te ondergaan, hun intracellulaire karakterisering is verder gecompliceerd. Als resultaat, in vitro-analyse van mitochondriën blijft de gangbare methode, om de intrinsieke eigenschappen van mitochondriën afzonderlijk te extraheren en te begrijpen, zonder de interferentie van andere subcellulaire organellen.

In een recente studie, nu gepubliceerd in Microsystemen en nano-engineering , Habibur Rahman en collega's van de afdeling Biomedische Technologie onderzochten de mogelijkheid om hydrodynamische stress te beheersen voor efficiënte mitochondriale extractie. Voor deze, ze gebruikten cross-junction microfluïdische geometrie op microschaal om het celmembraan selectief te verstoren en tegelijkertijd de integriteit van het mitochondriale membraan te waarborgen.

Vooruitgang in microfluïdica heeft de voordelen aangetoond van on-chip laboratoriumprocedures met een aanzienlijk kleinere steekproefomvang en verhoogde experimentele reproduceerbaarheid. Hydrodynamische stress geproduceerd in microfluïdische chips kan worden gebruikt om cellulaire of nucleaire membranen tijdelijk te openen tijdens intracellulaire genafgifte. Het potentieel van dergelijke technieken is zelden onderzocht voor het extraheren van subcellulaire organellen, aangezien de beperkte geometrieën van microkanalen subcellulaire componentverstopping in de micromachines kunnen veroorzaken.

De auteurs optimaliseerden de experimentele werkingsomstandigheden op basis van eerdere studies om celmembranen effectief te versnipperen met behoud van intacte mitochondriën in modelzoogdiercellijnen. De modelcellijnen van belang waren menselijke embryonale niercellen (HEK293), muisspiercellen (C2C12) en neuroblastoomcellen (SH-SY5Y).

In het werkingsprincipe van de voorgestelde celvernietiger op microschaal, de wetenschappers maten het verschil in elastische modulus tussen het mitochondriale membraan en het celmembraan om de cel te verstoren terwijl het mitochondriale membraan behouden bleef. Een verhoogd stressniveau in het systeem zou celmembranen met hogere elastische moduli kunnen verstoren (zoals gezien bij de neuroblastoomcellijn). De studie vergeleek de eiwitopbrengst en de concentratie van geëxtraheerde functionele mitochondriën met behulp van de voorgestelde methode versus in de handel verkrijgbare kits voor een reeks celconcentraties.

De bevindingen toonden aan dat de voorgestelde celvernietigermethode op microschaal efficiënter was dan de commerciële kits door ongeveer 40 procent meer functionele mitochondriën op te leveren. De wetenschappers waren in staat om de structurele integriteit van de geëxtraheerde organellen te behouden, zelfs bij lage celconcentraties. De methode kon een beperkte hoeveelheid monsters (200 µl) snel verwerken.

De gedetailleerde resultaten waren een primeur in studiedemonstratie van intacte en functionele mitochondriën-extractie met behulp van hydrodynamische stress op microschaal. De mogelijkheid om een ​​lage concentratie en een kleine steekproefomvang te verwerken, is gunstig voor klinisch onderzoek naar mitochondriale ziekten. Om de spanning te testen die wordt uitgeoefend door de ontworpen dwarsverbinding, ze gebruikten eerst een COMSOL Multiphysics simulatiemodel. Daarna, Rahman et al. experimenteel bepaald de volumetrische stroomsnelheid voor drie modelcellijnen. Tijdens experimentele celmembraanverstoring, onder gemiddelde schuifspanning (16,4 Pa, voor een stroomsnelheid van 60 l/min), subcellulaire organellen werden vrijgegeven en gedetecteerd met verhoogde mitochondriale positieve signalen.

De wetenschappers vergeleken de capaciteit van de geminiaturiseerde celvernietiger met die van twee commerciële kits:de Dounce-homogenisator (mechanische methode van celverstoring) en de Qproteome mitochondria-isolatiekit (chemische methode van celverstoring) om mitochondriën te extraheren. Om het aantal geëxtraheerde functionele mitochondriën te bepalen, de wetenschappers gebruikten MitoTracker - een fluorescerende kleurstof die mitochondriën kleurt tijdens flowcytometrische analyse. De resultaten toonden aan dat de celvernietiger op microschaal 40 procent meer functionele mitochondriën kon extraheren in vergelijking met de commerciële kits voor zowel HEK 293- als C2C12-cellen.

Rahman et al. voerde de citraatsynthase-assay uit om de mitochondriale integriteit te bepalen door enzymatische activiteit van beschadigde mitochondriën. Zoals eerder, vergeleken met de commerciële kits, mitochondriale integriteit was hoger voor degenen die werden geëxtraheerd met behulp van de microschaal shredder in HEK293- en C2C12-cellen.

De studie toonde het belang van membraanstijfheid aan door het voorgestelde concept om neuroblastoomcelmembranen (SH-SY5Y) te verstoren, te valideren. Omdat het SH-SY5Y-celmembraan een hogere elasticiteitsmodulus had dan zowel HEK293- als C2C12-cellijnen, de wetenschappers moesten de volumetrische stroomsnelheid in de microschaal shredder optimaliseren om SH-SY5Y-celmembranen effectief te verstoren. Opnieuw, vergeleken met de commerciële kitextracties, het gebruik van de voorgestelde methode leverde een significant hogere concentratie eiwit en functionele mitochondriën op voor de cellijn van belang.

Op deze manier, Rahman et al. onderzocht de mogelijkheid om het celmembraan te verstoren om de integriteit van mitochondriale membranen in diverse zoogdiermodelcellijnen te behouden. Ze bepaalden de optimale extensionele spanning en stroomsnelheid in een bioreactor met microfluïdische dwarsdoorsnede, gebaseerd op de Young's modulus van de modelcellijn van belang. Tijdens het ontwerpen van kanalen, de wetenschappers hebben een insnoeringssectie opgenomen in de microfluïdische bioreactor die is vervaardigd met behulp van zachte lithografie.

De voorgestelde microfluïdische celversnipperaar toonde een superieur vermogen voor het extraheren van functionele mitochondriën en eiwitten door voor de eerste keer hydrodynamische stress te beheersen, vergeleken met in de handel verkrijgbare extractiekits voor celorganellen. De experimenten waren uitvoerbaar, zelfs met zeer kleine hoeveelheden monsters (200 µl volume, met 10 ⁴ cellen/ml) voor mogelijke klinische toepassingen. Rahman et al. waren in staat om het protocol getrouw te repliceren over drie cellijnen. Het experimentele werk kan worden vertaald naar een klinische setting om mitochondriale disfunctie-gerelateerde aandoeningen diepgaand te begrijpen.

© 2019 Wetenschap X Netwerk