Een nieuwe fly-through van het vliegenbrein stelt iedereen in staat om langs neuronen te zoeven en een van de 40 miljoen synapsen te bezoeken waar neuronen neuronen raken. Het is een superresolutieweergave van de complexe netwerkverbindingen in de hersenen van het insect die ten grondslag liggen aan gedrag variërend van eten tot paren.

Wat is ongekend, echter, is dat deze 3D-kaart over het hele vliegenbrein, die details laat zien zo klein als 60 nanometer breed, werd gevangen in minder dan drie dagen.

Hoewel het detailniveau niet zo goed is als dat verkregen met een elektronenmicroscoop, inspanningen om de neuronen en synapsen van het vliegenbrein volledig in kaart te brengen met EM hebben 10 jaar geduurd en de inspanningen van tientallen mensen. De nieuwe kaart werd duizend keer sneller verkregen door twee ultramoderne technieken te combineren, expansiemicroscopie en rooster-lichtbladmicroscopie.

Een fijnschalige kaart van het volledige neurale netwerk van de hersenen - het menselijk brein maar ook dat van de muis en vlieg - is al tientallen jaren een droom van neurowetenschappers. ermee, ze konden de verbindingen tussen neuronen traceren om te begrijpen hoe de hersenen beslissingen nemen. En door synapsen te tellen, neurowetenschappers konden de sterkte van neurale verbindingen beoordelen, zoals degenen die verantwoordelijk zijn voor het geheugen.

De nieuwe en snellere beeldvormingstechniek van het hele brein zal wetenschappers helpen de neurale circuits van vliegen te ontrafelen die uiteindelijk ook ten grondslag liggen aan het functioneren van het menselijk brein. En het werkt even goed voor het in kaart brengen van de neurale circuits in kleine stukjes van het muizenbrein, en mogelijk het menselijk brein.

"Je kunt jaren en jaren besteden aan het maken van een EM-beeld van één vliegenbrein, " zei Nobelprijswinnaar Eric Betzig, die de raster-lichtbladmicroscoop uitvond toen hij op de Janelia Research Campus van het Howard Hughes Medical Institute zat en nu hoogleraar moleculaire en celbiologie en natuurkunde is aan de Universiteit van Californië, Berkeley. "Ik zie dat we op het punt komen om minstens 10 vliegenhersenen per dag in beeld te brengen."

Door een dergelijke snelheid en resolutie kunnen wetenschappers nieuwe vragen stellen, hij zei, zoals hoe hersenen verschillen tussen mannen en vrouwen, of hoe hersencircuits variëren tussen vliegen van hetzelfde type.

"We hebben een drempel overschreden in beeldprestaties, " zei Edward Boyden van het Massachusetts Institute of Technology, die vijf jaar geleden expansiemicroscopie uitvond. "Daarom zijn we zo opgewonden. We scannen niet alleen stapsgewijs meer hersenweefsel, we scannen hele hersenen."

Betzig, Boyden en hun teams publiceren deze week hun bevindingen in het tijdschrift Wetenschap .

Combinatie van expansie en licht-velmicroscopie

De nieuwe hersenscantechniek kwam tot stand nadat Boyden Betzigs hulp had gevraagd bij het combineren van expansiemicroscopie met Betzigs nieuwste high-speed beeldvormingstechniek, rooster licht-sheet microscopie. Expansiemicroscopie (ExM) omvat het fixeren van weefsel en het vervolgens uitbreiden als een ballon, terwijl de relatieve posities van interne structuren ongewijzigd blijven. Het gebruikt een polyacrylamidegel zoals die in luiers, dat opzwelt wanneer het van zout naar zuiver water wordt verplaatst. Lattice light-sheet microscopie (LLSM) maakt gebruik van zeer gerichte lichtstralen om snel een 3D-beeld van een monster te assembleren, één dun plakje tegelijk.

"Toen ze in 2016 voor het eerst bij mij kwamen, Ik was nog steeds een scepticus; Ik was bezorgd, eerst, of je zoiets zou kunnen uitbreiden zonder het als een gek te laten vervormen, ' zei Betzig. 'En toen was ik bang dat, terwijl de monsters transparant zijn, ze zouden het licht nog steeds vervormen als een zak knikkers."

Werken op de Janelia-campus, de gecombineerde teams, onder leiding van postdocs Ruixuan Gao en Shoh Asano van Boyden's MIT-lab en Srigokul Upadhyayula van Harvard Medical School, ontdekte dat na uitbreiding van het hersenweefsel met een factor vier, tot een volume dat 64 keer normaal is, het was bijna zo helder als water en onvervormd.

"Ik was geschokt over hoe perfect de open plek was om het ongelooflijk optisch uniform te maken, " hij zei.

Als resultaat, de lattice light-sheet-microscoop was in staat om een ​​zeer gedetailleerd en nauwkeurig beeld van de hersenen te produceren op het niveau van enkele synapsen:een resolutie van ongeveer 60 nanometer, dat is slechts een tiende van de resolutie van EM. De meerkleurige beeldvorming duurde slechts 62,5 uur.

De teams testten de ExLLSM-techniek niet alleen op het hele fruitvliegbrein, maar ook op een stukje muizenhersenen dat de millimeter dikke cortex overspant, met vergelijkbare resultaten. Ze waren in staat om alle synapsen in het vliegenbrein te tellen, in totaal zo'n 40 miljoen. Het menselijk brein, met 80 miljard neuronen en misschien 7, 000 synapsen per neuron, zou veel uitdagender zijn.

Betzig voorspelt, echter, dat met verbeteringen in expansiemicroscopie - sommige wetenschappers hebben weefsel 25 keer in elke richting uitgerekt - de gecombineerde technieken resultaten zouden kunnen bereiken die bijna net zo goed zijn als EM wat betreft het in kaart brengen van alle neurale verbindingen in de hersenen, een veld dat bekend staat als connectomics.

"Als je het 10 keer of misschien 15 keer expansie zou kunnen laten werken, je zou waarschijnlijk een groot deel van de EM failliet kunnen laten gaan, " zei hij. "Het is misschien goed genoeg om de dichte neurale tracering te doen die EM kan doen, maar veel sneller en goedkoper. Ik denk dat ze op hun hoede moeten zijn. Het is er nog niet, maar volgens mij het potentieel is er."

Fluorescentiemicroscopie

Beide microscooptechnieken omvatten het labelen van eiwitten in het weefsel met fluorescerende markers. Bij expansiemicroscopie, het weefsel wordt vervolgens doordrenkt met de gel en de markers worden verknoopt met de gelstructuur. Dan wordt al het eiwit verteerd, wat Betzig een 'fluorescerend fantoom' noemt. Door de zoutconcentratie van de media te veranderen, zwelt de gel op, de markeringen ermee te slepen. Het wordt meestal water, wat de duidelijkheid ervan verklaart.

Boyden gebruikte oorspronkelijk confocale lichtmicroscopie om het uitgezette weefsel in beeld te brengen, maar hij hoopte dat LLSM het monster sneller en met een nog betere resolutie zou afbeelden, terwijl ook het volledige verlies van fluorescentiesignaal wordt overwonnen dat optreedt bij beeldvorming diep in dikke specimens met conventionele middelen. LLSM scant een lichtstraal zo smal als 400 nanometer, vliegtuig voor vliegtuig door het monster, beeldvorming van de fluorescentie van de markeringen in elk verlicht vlak

Elke volledige scan, bijna 10 terabyte aan gegevens, wordt vervolgens door de computer geassembleerd tot een 3D-beeld dat kan worden genavigeerd als een videogame. De tijdrovende vergadering werd geleid door Janelia computerwetenschappers Stefan Saalfeld en Igor Pisarev, en vervolgens geanalyseerd en gevisualiseerd door Upadhyayula, die binnenkort een ultramodern beeldvormingslab zal openen aan UC Berkeley.

Door fluorescerende markers aan een van de 10 te bevestigen, 000 eiwitten in de hersenen, het moet mogelijk zijn om de buitenmembranen van neuronen en andere cellen in kaart te brengen, de synapsen waar het ene neuron in verbinding staat met het andere, de interne compartimenten van hersencellen, en nog veel meer.

Er zijn beperkingen, echter. Zoals bij elke vorm van fluorescentiemicroscopie met superresolutie, Betzig zei, het kan moeilijk zijn om eiwitten te decoreren met voldoende fluorescerende lampen om ze duidelijk te zien met een hoge resolutie. En aangezien expansiemicroscopie veel bewerkingsstappen vereist, er is nog steeds de mogelijkheid dat artefacten worden geïntroduceerd. Daarom, hij zei, "We hebben heel hard gewerkt om te valideren wat we hebben gedaan, en anderen zouden er goed aan doen hetzelfde te doen."