Een innovatieve benadering voor het kalibreren van hightech microscopen stelt onderzoekers in staat om de beweging van afzonderlijke moleculen in 3D op nanoschaal te volgen.

Een onderzoeksteam van Stanford University, onder leiding van W.E. Moerner, breidt het werk uit dat Moerner en collega's Eric Betzig en Stefan W. Hell de 2014 Nobelprijs voor Scheikunde opleverde. Betzig en Moerner pionierden met de ontwikkeling van beeldvorming met superresolutie, die de diffractielimiet van optische microscopie doorbrak door voor het eerst de fluorescentie van afzonderlijke moleculen te gebruiken. Het nieuwe werk, gepubliceerd in het high impact tijdschrift van The Optical Society optiek , toont een duidelijke verbetering in de nauwkeurigheid van deze beeldvormingstechniek en voor het volgen van moleculen in drie dimensies.

Volgen hoe moleculen bewegen, vormen vormen en interageren binnen de lichaamscellen en neuronen biedt een krachtige nieuwe kijk op belangrijke biologische processen zoals signalering, celdeling en neuroncommunicatie, die allemaal van invloed zijn op de gezondheid van mensen en de vatbaarheid voor ziekten.

Kapitaliseren op een transformatie in microscopie

Superresolutiemicroscopie maakt gebruik van lasers om fluorescentie van afzonderlijke moleculen op te wekken onder omstandigheden waarin er maar een paar tegelijk uitzenden, het overwinnen van de traditionele resolutielimiet voor optische microscopie die is ingesteld door de diffractielimiet van licht.

"Met de komst van beeldvorming met superresolutie, we hebben de resolutie met een factor 5 tot 10 verbeterd boven de diffractielimiet - van 200 nanometer naar 40 of zelfs 10 nanometer, "Zei Moerner. "Deze nieuwe wereld met een sterk verhoogde resolutie brengt een grote transformatie met zich mee in de manier waarop het optische systeem werkt."

Echter, eerdere kalibratietechnieken voor superresolutiemicroscopie waren niet voldoende nauwkeurig voor 3D-metingen van afzonderlijke moleculen. De nieuwe kalibratiemethode maakt gebruik van een nanohole-array om optische vervormingen over het gehele gezichtsveld van een groothoekmicroscoop te corrigeren.

Omgaan met vervorming

Bij beeldvorming op de schaal van enkele moleculen, een enkel lichtpunt dat van een molecuul komt, kan doorgaans worden gelokaliseerd met een precisie van ongeveer 10 nanometer. Bij zulke hoge resoluties, eventuele kleine onvolkomenheden in een optisch systeem leiden tot beeldvervormingen, of afwijkingen, die metingen aanzienlijk kan vertekenen, vooral in 3D. De resulterende fouten kunnen het verschil betekenen tussen het interpreteren van twee moleculen als interactief of gewoon dicht bij elkaar.

Hoewel velen fluorescerende kralen gebruiken om 3D-microscopen te kalibreren, Alex van Diezmann, promovendus bij het Moerner Lab, Stanford universiteit, een andere benadering gekozen. Hij maakte een reeks gaten in een metaalfilm, elk kleiner dan 200 nanometer en op regelmatige afstanden van 2,5 micron, te gebruiken als een 3D-kalibratiestandaard. Nadat de gaten waren gevuld met fluorescerende kleurstoffen, de array kan worden gebruikt om te kalibreren voor optische fouten over het gehele gezichtsveld van de microscoop, niet alleen op een paar geselecteerde plekken, zoals mogelijk is met behulp van fluorescerende kralen. Met behulp van deze techniek, de onderzoekers konden aberraties van 50-100 nanometer corrigeren tot slechts 25 nanometer.

"Voorafgaand aan deze men had zich niet expliciet zorgen gemaakt over deze afwijkingen, von Diezmann zei. "Het feit dat we de aanwezigheid van veldafhankelijke afwijkingen hebben aangetoond, en toonden aan dat ze beelden konden degraderen, is een belangrijk onderdeel van dit werk."

De onderzoekers bestudeerden de nieuwe kalibratietechniek met dubbele helix en astigmatische puntspreidingsfuncties, twee soorten optische modificatie die doorgaans worden gebruikt om de locatie van de z-as te extraheren. Hoewel beide puntspreidingsfuncties z-as gerelateerde onnauwkeurigheden vertoonden die een fout van ongeveer 20 procent in de 3D-metingen veroorzaakten, de onderzoekers corrigeerden deze aberraties met behulp van de 3D nanohole-array.

Voordelen aantonen voor de studie van eiwitten in bacteriën

De onderzoekers passen nu de nieuwe 3D-kalibratietechniek toe op al hun single-molecule tracking en superresolutie microscopiestudies. Bijvoorbeeld, von Diezmann gebruikt het om eiwitlokalisatie te bestuderen in bacteriën die slechts twee micron lang zijn. Met de 3D-kalibratietechniek, hij kan de belangrijkste signaaleiwitten nauwkeurig meten en volgen in nanodomeinen die slechts 150 tot 200 nanometer groot zijn.

De onderzoekers wijzen erop dat het corrigeren van veldafhankelijke en andere soorten aberraties steeds belangrijker wordt naarmate optische microscopietechnieken evolueren om dieper in cellen in beeld te komen, bijvoorbeeld.

"We hebben deze aanpak voor een paar gevallen bestudeerd, maar het kan worden gebruikt met elke superresolutie- of lokalisatiemicroscopie die echt nauwkeurige 3D-metingen vereist, " zei von Diezmann. "Het zal opwindend zijn om te zien hoe andere groepen het gebruiken om erachter te komen hoe hun specifieke techniek wordt beïnvloed door veldafhankelijke aberraties. Als gemeenschap, misschien kunnen we nog betere manieren vinden om met deze afwijkingen om te gaan."

Onderzoekers produceerden een 3D-kalibratietool door een reeks gaten op nanoschaal te maken gevuld met fluorescerende kleurstof. In een), widefield verlichting (groen) gaat door het glazen dekglaasje in een nanogat geëtst in een laag aluminium. De oplossing van fluorescerende kleurstof vult de gaten, en de resulterende lichtpunten (oranje) worden van onderaf gedetecteerd. Figure (b) shows a scanning electron microscope image of the holes, which are each 200 nanometers or less in diameter.