Conventionele microscopen bieden essentiële informatie over monsters in twee dimensies:het vlak van het objectglaasje. Maar plat is niet alles. In veel gevallen, informatie over het object in de derde dimensie - de as loodrecht op het objectglaasje - is net zo belangrijk om te meten.

Bijvoorbeeld, om de functie van een biologisch monster te begrijpen, of het een DNA-streng is, zakdoek, orgaan of microscopisch organisme, onderzoekers willen graag zoveel mogelijk informatie hebben over de driedimensionale structuur en beweging van het object. Tweedimensionale metingen leveren een onvolledig en soms onbevredigend begrip van het monster op.

Nu hebben onderzoekers van het National Institute of Standards and Technology (NIST) een manier gevonden om een ​​probleem om te zetten dat van invloed is op bijna alle optische microscopen:lensafwijkingen, die een onvolmaakte focussering van licht veroorzaken - in een oplossing waarmee conventionele microscopen nauwkeurig de posities van lichtpunten op een monster in alle drie de dimensies kunnen meten.

Hoewel andere methoden ervoor hebben gezorgd dat microscopen gedetailleerde informatie over de driedimensionale structuur kunnen geven, deze strategieën zijn vaak duur of vereisen gespecialiseerde kennis. In een eerdere benadering van het meten van posities in de derde dimensie, onderzoekers veranderden de optica van microscopen, bijvoorbeeld door extra astigmatisme aan de lenzen toe te voegen. Dergelijke wijzigingen vereisten vaak een re-engineering en herkalibratie van de optische microscoop nadat deze de fabriek had verlaten.

De nieuwe meetmethode stelt microscopen ook in staat om de posities van objecten nauwkeuriger en nauwkeuriger te lokaliseren. Optische microscopen lossen doorgaans de posities van objecten op tot een gebied dat niet kleiner is dan een paar honderd nanometer (miljardste van een meter), een limiet die wordt bepaald door de golflengte van het licht dat het beeld maakt en het oplossend vermogen van de microscooplenzen. Met de nieuwe techniek, conventionele microscopen kunnen de posities van individuele lichtemitterende deeltjes bepalen binnen een gebied dat een honderdste zo klein is.

NIST-onderzoekers Samuel Stavis, Craig Copeland en hun collega's beschreven hun werk in het nummer van 24 juni van Natuurcommunicatie .

De methode steunt op een zorgvuldige analyse van afbeeldingen van fluorescerende deeltjes die de onderzoekers op platte siliciumwafels hebben gedeponeerd voor kalibratie van hun microscoop. Door lensafwijkingen terwijl de microscoop op en neer bewoog met specifieke stappen langs de verticale as - de derde dimensie - leken de beelden scheef en leken de vormen en posities van de deeltjes te veranderen. De NIST-onderzoekers ontdekten dat de aberraties grote vervormingen in beelden kunnen veroorzaken, zelfs als de microscoop slechts enkele micrometers (miljoensten van een meter) in het laterale vlak of enkele tientallen nanometers in de verticale dimensie beweegt.

De analyse stelde de onderzoekers in staat om precies te modelleren hoe de lensafwijkingen het uiterlijk en de schijnbare locatie van de fluorescerende deeltjes veranderden met veranderingen in de verticale positie. Door het veranderende uiterlijk en de schijnbare locatie van een deeltje zorgvuldig af te stemmen op zijn verticale positie, het team slaagde erin de microscoop te gebruiken om posities in alle drie de dimensies nauwkeurig te meten.

"Niet intuïtief, lensafwijkingen beperken de nauwkeurigheid in twee dimensies en maken nauwkeurigheid in drie dimensies mogelijk, "zei Stavis. "Op deze manier, onze studie verandert het perspectief van de dimensionaliteit van optische microscoopbeelden, en onthult het potentieel van gewone microscopen om buitengewone metingen te doen."

Het gebruik van de latente informatie van lensafwijkingen vormt een aanvulling op de minder toegankelijke methoden die microscopistes momenteel gebruiken om metingen in de derde dimensie uit te voeren, merkte Stavis op. De nieuwe methode heeft de potentie om de beschikbaarheid van dergelijke metingen te verbreden.

De wetenschappers testten hun kalibratiemethode door met de microscoop een beeld te vormen van een constellatie van fluorescerende deeltjes die willekeurig waren afgezet op een microscopisch siliciumtandwiel dat in alle drie de dimensies draaide. De onderzoekers toonden aan dat hun model nauwkeurig corrigeerde voor de lensafwijkingen, waardoor de microscoop volledige driedimensionale informatie kan geven over de positie van de deeltjes.

De onderzoekers waren vervolgens in staat om hun positiemetingen uit te breiden om het volledige bewegingsbereik van de versnelling vast te leggen, inclusief de roterende, wiebelen en wiebelen, het voltooien van de extractie van ruimtelijke informatie uit het systeem. Deze nieuwe metingen benadrukten de gevolgen van hiaten op nanoschaal tussen microsysteemonderdelen, die varieerde als gevolg van onvolkomenheden in de fabricage van het systeem. Net zoals een losse lager op een wiel ervoor zorgt dat het gaat wiebelen, de studie toonde aan dat de gaten op nanoschaal tussen onderdelen niet alleen de precisie van de opzettelijke rotatie verslechterden, maar veroorzaakte ook onbedoeld wiebelen, schommelen en zelfs buigen van de versnelling, die allemaal de prestaties en betrouwbaarheid kunnen beperken.

Microscopielaboratoria zouden de nieuwe methode gemakkelijk kunnen implementeren, aldus Copeland. "De gebruiker heeft alleen een standaardmonster nodig om hun effecten te meten en een kalibratie om de resulterende gegevens te gebruiken, " voegde Stavis toe. Afgezien van de fluorescerende deeltjes of een vergelijkbare standaard, die al bestaan ​​of in opkomst zijn, geen extra apparatuur nodig. Het nieuwe tijdschriftartikel bevat demonstratiesoftware die onderzoekers begeleidt bij het toepassen van de kalibratie.