Een onderzoeksgroep onder leiding van Takashi Saito, van de Ehime University Graduate School of Medicine, ontwikkelde een 2-foton excitatie licht-sheet fluorescentiemicroscoop die (1) fototoxiciteit verlaagt, (2) vergroot het gezichtsveld, en (3) verhoogt de ruimtelijke resolutie. Deze microscoop, wanneer gebruikt voor de observatie van medaka-vissen, maakte het mogelijk om het hele lichaam van het embryo (een uitgebreid gezichtsveld) te observeren met een resolutie op celniveau (hoge ruimtelijke resolutie) zonder de groei van de vis te beïnvloeden (lage fototoxiciteit) gedurende een periode van drie dagen van embryonale ontwikkeling. Dit resultaat is gepubliceerd in het wetenschappelijke tijdschrift Natuurcommunicatie .

De fluorescentiemicroscoop wordt veel gebruikt in de biowetenschappen om moleculen in een cel op een niet-invasieve manier te observeren. Light-sheet fluorescentiemicroscopie maakt het mogelijk om driedimensionale beelden op te nemen met een hoge acquisitiesnelheid en een hoge ruimtelijke resolutie. Echter, in conventionele lichtbladmicroscopen, het is moeilijk om fotoschade te beperken tot levende weefsels, en ook moeilijk om tegelijkertijd een brede FOV en een hoge ruimtelijke resolutie (op celniveau) te bereiken.

Ontwikkeling van een twee-foton excitatie wide-field, lichtbladmicroscoop

De onderzoeksgroep van de Ehime University van Takashi Saitou, Sota Takanezawa, en Takeshi Imamura gebruikte het twee-foton-excitatiefenomeen als een sleutel tot het oplossen van dit probleem. De twee-foton-excitatiemicroscoop met infraroodlasers maakt zachte (laag fototoxische) beeldvorming van levende organismen mogelijk. Echter, omdat het licht moet worden gefocust op een smal bereik om excitatie met twee fotonen te induceren, het excitatiebereik (in lichtbladmicroscoop, het gezichtsveld) is smal. Om dit op te lossen, de onderzoekers ontwikkelden een eenvoudige verlichtingsoptiekeenheid met een Bessel-straal die het laservoortplantingsbereik in de richting van de optische as uitbreidt (figuur 1A). Dit apparaat kan de straallengte uitrekken tot 600-1000 m met behoud van een axiale resolutie van 2-3 μm bij gebruik van een 10x vergroting NA0.3 objectieflens. Met behulp van deze optische eenheid, ze construeerden een twee-foton excitatie licht-sheet microscopie (Fig. 1B), wat het mogelijk maakt om beeldvorming van het hele lichaam van medaka-larven uit te voeren met cellulaire resolutie (figuur 1C).

De medaka wordt veel gebruikt als modelorganisme voor gewervelde dieren. Het is geschikt voor fluorescerende beeldvorming omdat het klein en transparant is. Om de toepasbaarheid van de microscoop voor gebruik op levende organismen te evalueren, de onderzoekers voerden een fototoxiciteitsbeoordeling uit. Dit bracht verminderde fotoschade aan het licht in vergelijking met de conventionele Gauss-lichtbladmicroscoop. Daarom wordt gesuggereerd dat het geschikt is voor live-beeldvorming op lange termijn. De onderzoekers pasten vervolgens time-lapse-beeldvorming op lange termijn toe van de transgene medaka waarin lymfatisch endotheel is gelabeld met groen fluorescerend eiwit, en slaagde in live-beeldvorming gedurende drie dagen met tussenpozen van vijf minuten (Fig. 2).

In dit onderzoek, de onderzoekers ontwikkelden een nieuwe high-performance light-sheet fluorescentiemicroscoop. Met behulp van deze technologie, wetenschappers kunnen bijna alle embryonale groeiprocessen van medaka-vissen observeren met een hoge cellulaire resolutie over het hele lichaam van de vis. Deze technologie zal naar verwachting bijdragen aan het begrip van de embryonale ontwikkeling op moleculair niveau, de opheldering van de pathogenese van leefstijlgerelateerde ziekten, en om de technologie van de ontwikkeling van geneesmiddelen te bevorderen.