Het Pools-Israëlische team van de Faculteit der Natuurkunde van de Universiteit van Warschau en het Weizmann Institute of Science heeft opnieuw een belangrijke prestatie geleverd op het gebied van fluorescentiemicroscopie. Op de pagina's van de optiek tijdschrift presenteerde het team een ​​nieuwe methode van microscopie die, in theorie, heeft geen resolutielimiet. In praktijk, het team slaagde erin een viervoudige verbetering boven de diffractielimiet aan te tonen.

De voortdurende ontwikkeling van biologische wetenschappen en geneeskunde vereist het vermogen om steeds kleinere objecten te onderzoeken. Wetenschappers moeten de structuur van en de onderlinge relaties tussen bijvoorbeeld, eiwitten in cellen. Tegelijkertijd, de monsters die worden geobserveerd mogen niet verschillen van de structuren die van nature voorkomen in biologische organismen, die het gebruik van agressieve procedures en reagentia uitsluit. Hoewel het een revolutie teweegbracht in de natuurwetenschappen, de klassieke optische microscoop is vandaag duidelijk onvoldoende. Door de golfachtige aard van licht, een optische microscoop laat geen beeldvormende structuren toe die kleiner zijn dan ongeveer 250 nanometer. Als resultaat, objecten die dichter bij elkaar liggen dan de helft van de golflengte van licht (wat ongeveer 250 nm is voor groen licht) kunnen niet worden onderscheiden. Dit fenomeen, bekend als de diffractielimiet, een van de belangrijkste obstakels bij het observeren van de kleinste biologische structuren, wetenschappers hebben lang geprobeerd te overwinnen. Elektronenmicroscopen bieden een orde van grootte betere resolutie, maar laten alleen het onderzoek van levenloze objecten toe, die in een vacuüm moet worden geplaatst en door een elektronenstraal moet worden gebombardeerd. Om deze reden, elektronenmicroscopie kan niet worden gebruikt voor het bestuderen van levende organismen en de natuurlijke processen die daarin plaatsvinden. Dit is waar fluorescentiemicroscopie van pas komt, vandaar de snelle ontwikkeling van superresolutiefluorescentiemicroscopie als een gebied van natuurwetenschappen en de twee Nobelprijzen die al zijn toegekend voor gerelateerd onderzoek - in 2008 en 2014.

Tegenwoordig zijn er verschillende technieken van fluorescentiemicroscopie beschikbaar, en sommigen van hen zijn wijdverbreid in biologische beeldvorming geworden. Sommige methoden, zoals PALM, STORM- of STED-microscopie, worden gekenmerkt door een ultrahoge resolutie en laten veeleisende objecten toe die zich op slechts een tiental nanometer van elkaar bevinden. Echter, deze technieken vereisen lange blootstellingstijden en een complexe procedure van biologische monstervoorbereiding. andere technieken, zoals SIM- of ISM-microscopie, zijn gemakkelijk te gebruiken, maar bieden een zeer beperkte resolutieverbetering, waardoor structuren slechts de helft van de grootte van de diffractielimiet kunnen worden geïdentificeerd.

Aleksandra Sroda, Adrian Makowski en Dr. Radek Lapkiewicz van het Quantum Optics Lab aan de Faculteit der Natuurkunde van de Universiteit van Warschau, in samenwerking met Dr. Ron Tenne, Uri Rossman, Gur Lubin en Prof. Dan Oron van het Weizmann Institute of Science in Israël, hebben een nieuwe techniek van superresolutiemicroscopie geïntroduceerd, Super-resolutie optische fluctuatie beeld scanning microscopie (SOFISM) genoemd. In het SOFISME, de natuurlijk voorkomende fluctuaties in emissie-intensiteit van fluorescerende markers worden gebruikt om de ruimtelijke resolutie van een beeld scanning microscoop (ISM) verder te verbeteren. ISM, een opkomende superresolutiemethode, is al geïmplementeerd in commerciële producten en is waardevol gebleken voor de bio-imaging-gemeenschap. Grotendeels, omdat het een bescheiden verbetering in laterale resolutie (x2) bereikt, met zeer weinig veranderingen aan de optische opstelling en zonder de gebruikelijke handicap van lange belichtingstijden. Dus, het maakt een natuurlijke uitbreiding van de mogelijkheden van een standaard confocale microscoop mogelijk. ISM gebruikt een confocale microscoop waarin een enkele detector wordt vervangen door een detectorarray. In SOFISM worden correlaties berekend van intensiteiten die door meerdere detectoren worden gedetecteerd. In principe, de meting van de n-de orde correlatie kan leiden tot een resolutieverbetering van factor 2n ten opzichte van de diffractielimiet. In praktijk, de resolutie die haalbaar is voor correlaties van hogere orde wordt beperkt door de signaal-ruisverhouding van de metingen.

"SOFISM is een compromis tussen gebruiksgemak en resolutie. Wij geloven dat onze methode de niche zal vullen tussen het complexe, moeilijk te gebruiken technieken die een zeer hoge resolutie bieden en de gebruiksvriendelijke methoden met een lagere resolutie. SOFISM heeft geen theoretische resolutielimiet, en in ons artikel, we demonstreren resultaten die vier keer beter zijn dan de diffractielimiet. We laten ook zien dat de SOFISM-methode een hoog potentieel heeft in de beeldvorming van driedimensionale biologische structuren, " zei Dr. Radek Lapkiewicz.

Cruciaal, SOFISME is, in zijn technische aspecten, zeer toegankelijk, omdat er slechts een kleine aanpassing aan de veelgebruikte confocale microscoop nodig is - de fotomultiplicatorbuis wordt vervangen door een SPAD-arraydetector. In aanvulling, het is noodzakelijk om de meettijd iets te verlengen en de gegevensverwerkingsprocedure te wijzigen. "Tot voor kort, SPAD-arraydetectoren waren duur en hun specificaties waren niet voldoende voor op correlatie gebaseerde microscopie. Deze situatie is recentelijk veranderd. De nieuwe SPAD-detectoren die vorig jaar zijn geïntroduceerd, hebben zowel de technologische als de prijsgerelateerde barrières weggenomen. Dit doet ons denken dat fluorescentiemicroscopietechnieken zoals SOFISM, in een paar jaar tijd, wijd worden gebruikt op het gebied van microscopisch onderzoek, " benadrukte Dr. Lapkiewicz.