Een miniatuur fluorescentiemicroscoop die minder weegt en toch een hoge resolutie biedt in vergelijking met bestaande apparaten, zal een scala aan toepassingen hebben in de systeembiologie. Bestaande miniatuur fluorescentiemicroscopen zijn een standaardtechniek in de biowetenschappen, maar ze bieden alleen tweedimensionale (2-D) informatie. In een nieuw verslag nu op Natuurlicht:wetenschap en toepassingen , Kyrollos Yanny, Nick Antipa en een team van wetenschappers in het Joint Graduate Program in Bioengineering, Elektrotechniek en computerwetenschappen aan de Universiteit van Californië, Berkeley en de Université libre de Bruxelles Belgium, ontwikkelde een single-shot 3D fluorescentiemicroscoop. Ze ontwikkelden het nieuwe apparaat dat bekend staat als de Miniscope3D door de buislens van een conventionele 2D-miniscoop te vervangen door een geoptimaliseerd multifocaal fasemasker bij de diafragmastop van het objectief. Met behulp van het apparaat, Yanny en Antipa et al. optisch geregistreerde neurale activiteit in vrij bewegende dieren en in langdurige in situ beeldvormingstoepassingen in incubators en in lab-on-a-chip-apparaten.

Miniatuur fluorescentiebeeldvorming en technische innovaties

Miniatuurfluorescentiemicroscopen zijn belangrijk in de systeembiologie voor optische opnames van neurale activiteit bij vrij bewegende dieren, langdurige in-situ beeldvorming in couveuses en medische apparatuur. Dergelijke microscopen worden ook wel "miniscopen" genoemd en zijn gemaakt van 3D-geprinte onderdelen, hoewel alleen 2-D fluorescentiebeeldvorming wordt aangeboden. Single-shot-methoden kunnen hogere opnamesnelheden mogelijk maken en een tijdelijke resolutie die wordt beperkt door de framesnelheid van de camera. Bijvoorbeeld, een eerder ontwikkelde miniatuur lichtveldmicroscoop (MiniLFM) kan neurale activiteit verwerken met een geoptimaliseerd algoritme. In dit werk, Yanny et al. ontwikkelde een 3D-miniscoop om een ​​hogere resolutie te bereiken met een lager gewicht in vergelijking met bestaande technieken. Het team testte de microscopische mogelijkheden door fluorescerende resolutiedoelen in beeld te brengen, evenals vrij zwemmende biologische monsters en hersenweefsel van muizen. Ze valideerden de gereconstrueerde resultaten in vergelijking met twee-fotonenmicroscopie om de limieten van de nieuwe techniek te begrijpen.

Om hoogwaardige beeldvorming te realiseren in een kleine, lichtgewicht apparaat, Yanny et al. plaatste het fasemasker (waar licht dat door het masker gaat een faseverschuiving zal ondergaan die evenredig is met de dikte van het materiaal) in Fourier-ruimte om de rekenbelasting te verminderen en de compactheid te verbeteren. Ze voegden 3D-mogelijkheden toe aan de 2D-miniscoop ten koste van een klein verlies in laterale resolutie en een lagere signaal-ruisverhouding. Het algoritme verenigde de optische theorie met gecomprimeerde waarneming om de geoptimaliseerde fasemaskers te fabriceren. De techniek maakte een nieuwe miniatuur 3D-microscooparchitectuur mogelijk met een hogere resolutie, open source-ontwerpen, fabricage van hogere kwaliteit en een efficiënt kalibratieschema of reconstructie-algoritme.

De computationele microscoop karakteriseren en het muizenbrein onderzoeken

Het team testte de prestaties van de computationele microscoop met behulp van monsters van toenemende complexiteit om 3D-dynamische opnames vast te leggen. Ze maten de laterale resolutie op verschillende diepten door een fluorescerend resolutiedoel af te beelden. Vervolgens valideerden ze de nauwkeurigheid van hun resultaten met behulp van twee-fotonmicroscopie. Bijvoorbeeld, de Miniscope3D kon nauwkeurig alle gereconstrueerde afbeeldingen van de nabewerking van het 3D-fluorescerende kraalmonster herstellen. Ze toonden het potentieel van de methode aan met behulp van neurobiologische monsters waarbij gebieden met groen fluorescerend eiwit getagd schaarse populaties van neuronen in het monster tot expressie brachten. De gereconstrueerde beelden verkregen uit verschillende delen van de hippocampus toonden dendrieten die over het oppervlak liepen naast individuele cellichamen. Toen Yanny et al. onderzocht vervolgens dynamische voorbeelden van vrij zwemmen, groen geverfde tardigrades (ook bekend als waterberen), de gereconstrueerde beelden toonden de efficiëntie van Miniscope3D-beeldvorming om vrij bewegende biologische organismen met hoge resolutie in ruimte-tijd te volgen.

Toepassingen en toegankelijkheid van het apparaat

De meeste toepassingen van Miniscope3D zullen vergelijkbaar zijn met 3D-microscopie en MiniLFM (miniatuurlichtveldmicroscopie), die wordt beschouwd als de gouden standaard voor single-shot miniatuur 3D-fluorescentiebeeldvorming. Vergeleken met MiniLFM, echter, de nieuwe Miniscope3D-methode bood meerdere verbeteringen, waaronder multifocale lenzen, best-case laterale resolutie en een 10-voudige toename van het bruikbare meetvolume. De verbeterde prestaties kwamen aan in een hardwarepakket dat kleiner was dan de MiniLFM met een lager gewicht om vrij bewegende organismen te observeren. De methode maakte verder experimentele reconstructie mogelijk met of zonder verstrooiing voor hersenweefsel van muizen met een resolutie van één neuron. Het team zal de bestaande limieten van het apparaat optimaliseren, waaronder verstrooiing, voor verdere toepassingen.

Door voort te bouwen op een populair open-source miniscope-platform, Yanny et al. zorgde voor toegankelijkheid voor het Miniscope3D-ontwerp. Op deze manier, Kyrollos Yanny, Nick Antipa en collega's boden een 3D-prototype aan om de 2D-miniscopen die momenteel in 450 laboratoria worden gebruikt, te upgraden. De experimentele resultaten waren in goede overeenstemming met het theoretische ontwerp en de analyse om te dienen als een nuttig raamwerk voor op maat gemaakte single-shot 3D-systemen.

© 2020 Wetenschap X Netwerk