Wetenschappers van EPFL hebben robuuste en eenvoudig te implementeren veelkleurige superresolutie-beeldvorming ontwikkeld. De aanpak is gebaseerd op de gelijktijdige verwerving van twee spectrale kanalen, gevolgd door spectrale cross-cumulant-analyse en ontmenging. Ze maken gebruik van fluorofoor knipperen en spectrale overspraak voor het genereren van extra kleurkanalen met super-opgeloste beelden.

Multicolor fluorescentiemicroscopie is een belangrijk hulpmiddel voor de biowetenschappen om de relatieve rangschikking van cellulaire structuren of de interacties van verschillende eiwitten te bestuderen. Echter, conventionele microscopen, de werkpaarden voor veel biologische studies, kan alleen details oplossen in de orde van de golflengte van licht. In de afgelopen twee decennia is verschillende superresolutiemicroscopieconcepten hielpen onderzoekers om deze diffractielimiet te overwinnen en nieuwe ontdekkingen te doen. Deze nieuwe methoden vinden slechts langzaam hun weg naar routinematige biologische toepassingen. Voor een aantal van de nieuwe technieken dit komt door complexe microscoophardware, maar ook verhoogde eisen aan monstervoorbereiding en fluorescerende labels vormen aanzienlijke hindernissen. De vereisten voor succesvolle beeldvorming met superresolutie zijn nog uitdagender om te voldoen voor meerkleurige toepassingen.

EPFL's laboratorium voor biomedische optica onder leiding van Theo Lasser heeft uitgebreid gewerkt aan Super-resolution Optical Fluctuation Imaging (SOFI) om de ruimtelijke resolutie en bemonstering in 2D en 3D te vergroten. SOFI is een alternatief voor Single-molecule Localization Microscopie-technieken zoals STORM en PALM. Het analyseert hogere orde spatio-temporele statistieken van een tijdreeks van knipperende fluoroforen en vereist geen isolatie van individuele fluoroforen-emissies. SOFI is compatibel met een breder scala aan etiketterings- en beeldvormingsomstandigheden, wat de selectie en experimenten van fluorofoor vereenvoudigt. In hun nieuwe studie onderzoekers van de School of Engineering onder leiding van Theo Lasser en Aleksandra Radenovic (hoofd van het Laboratory of Nanoscale Biology) breidden de statistische analyse uit naar het spectrale domein om de weg vrij te maken naar een nieuwe benadering voor meerkleurige superresolutie-beeldvorming.

Het aantal kleuren wordt niet beperkt door de spectrale kanalen van de microscoop of het benutten van spectrale overspraak

Het idee achter de veelkleurige SOFI-aanpak is het volgende. Bij klassieke veelkleurige beeldvorming moet overspraak tussen verschillende spectrale kanalen van de microscoop worden vermeden. Hier, de onderzoekers benutten de overspraak om extra kleurkanalen te genereren. Ze passen cumulatieve analyse toe tussen meerdere gelijktijdig verkregen spectrale kanalen. De statistische analyse stelt hen in staat om de fysieke detectiekanalen van de microscoop aan te vullen met extra virtuele spectrale kanalen. "Alleen de signalen die ruimtelijk en tijdelijk gecorreleerd zijn in de verschillende spectrale kanalen, verschijnen in de virtuele kanalen. We pikken precies de overspraak op waar iedereen vanaf wil." legt Kristin Grußmayer uit, een van de hoofdauteurs van het onderzoek. De extra computationeel gegenereerde spectrale kanalen samen met lineaire ontmenging maken het mogelijk om meer verschillende fluorofoorkleuren af ​​te beelden dan geregistreerde fysieke detectiekanalen.

De publicatie biedt de theorie achter spectrale cross-cumulant multicolor SOFI en bevat een raamwerk om de spectrale kanalen van de microscoop te optimaliseren voor een bepaalde combinatie van fluoroforen die in beeld moeten worden gebracht. Gesimuleerde datasets hielpen het team om te verifiëren dat hun nieuwe veelkleurige benadering zou moeten werken voor een breed scala aan labels met verschillende fotofysische eigenschappen, zelfs voor degenen met sterk overlappende emissiespectra. "We konden aantonen dat onze aanpak werkt voor driekleurenbeeldvorming in vaste en in levende cellen voor een verscheidenheid aan kleurstoffen en fluorescerende eiwitten. De beeldvorming kan worden uitgevoerd met behulp van commerciële breedveldopstellingen met tweekanaals beeldsplitsingseenheden die algemeen verkrijgbaar zijn. , we zijn niet beperkt tot 3 kleuren", zegt Kristin Grußmayer.

Instructies voor het uitvoeren van meerkleurige spectrale cross-cumulante SOFI-analyse zijn beschikbaar op de webpagina van het Laboratorium voor Nanoschaalbiologie onder www.epfl.ch/labs/lben/sofi-packages/ en het softwarepakket kan worden gedownload op www.epfl.ch/ labs/lben/wp-content/uploads /2020/05/multicolor_sofi_v2.3.zip .