Een team van wetenschappers en ingenieurs van het Brookhaven National Laboratory van het Amerikaanse Department of Energy (DOE) heeft een nieuw wetenschappelijk instrument ontwikkeld dat ultranauwkeurige en snelle karakterisering van eiwitkristallen mogelijk maakt bij de National Synchrotron Light Source II (NSLS-II)— een DOE Office of Science User Facility in Brookhaven, die röntgenstralen met hoge energie genereert die kunnen worden gebruikt om de eiwitkristallen te onderzoeken. De FastForward MX-goniometer genoemd, dit geavanceerde instrument zal de efficiëntie van eiwitkristallografie aanzienlijk verhogen door de looptijd van experimenten te verkorten van uren tot minuten.

Eiwitkristallografie is een essentiële onderzoekstechniek die röntgendiffractie gebruikt om de 3D-structuren van eiwitten en andere complexe biologische moleculen bloot te leggen, en hun functie in onze cellen te begrijpen. Met behulp van deze kennis over de basisstructuur van het leven, wetenschappers kunnen het ontwerp van geneesmiddelen bevorderen, medische behandelingen verbeteren, en ontrafelen van andere milieu- en biochemische processen die ons dagelijks leven beheersen.

Om deze techniek te laten werken, eiwitten moeten worden gekristalliseerd - en de meest uitdagende eiwitten groeien vaak alleen uit tot kleine microkristallen. Om deze complexe eiwitstructuren te reconstrueren, wetenschappers moeten röntgendiffractiegegevens van duizenden microkristallen meten en de verzamelde gegevens samenvoegen, een techniek die seriële kristallografie wordt genoemd. Deze metingen nemen momenteel uren in beslag met zeer gespecialiseerde en geavanceerde onderzoeksinstrumenten bij synchrotron macromoleculaire kristallografiebundellijnen om te voltooien. Macromoleculaire kristallografiebundellijnen zijn te vinden in bijna elke synchrotronstralingsfaciliteit ter wereld en gebruiken de intense röntgenstralen van de lichtbronnen om de atomaire structuur van de eiwitten te karakteriseren.

"Door gebruik te maken van onze nieuwe ultrasnelle en uiterst nauwkeurige FastForward MX-goniometer, we zijn in staat om seriële kristallografiegegevens zo snel te verzamelen dat complete datasets nu in slechts enkele minuten kunnen worden verkregen, " zei Martin Fuchs, de hoofdwetenschapper bij de Frontier Microfocusing Macromolecular Crystallography (FMX) bundellijn bij NSLS-II. "Onze nieuwe goniometer maakt optimaal gebruik van de uitzonderlijke bundeleigenschappen van NSLS-II, en dus van de toonaangevende heldere röntgenstralen die beschikbaar zijn op onze bundellijn."

Het team ontwikkelde de nieuwe goniometer speciaal voor de één micrometer grote, intense röntgenstraal. FMX geeft onderzoekers nu de unieke mogelijkheid om röntgendiffractiegegevens van ongelooflijk kleine kristallen te meten met veel hogere snelheden dan bij enige andere synchrotron-lichtbron.

"De kleine bundelgrootte samen met onze nieuwe snelle scantechniek geeft ons de mogelijkheid om de structuur van biologische moleculen te bepalen uit kleine eiwitkristallen die voorheen niet groot genoeg zouden zijn om gegevens te verzamelen van, ' zei Fuss.

De goniometer kan eiwitkristallen positioneren met een precisie van 25 nanometer (4, 000 keer kleiner dan de breedte van een mensenhaar) en zorgt ervoor dat de kleine röntgenstraal microkristallen nauwkeurig kan verlichten voor diffractiemetingen.

"Om deze precisie en snelheid te bereiken, moesten we veel technologische uitdagingen overwinnen. we moesten een manier ontwikkelen om het kristal in deze extreem kleine stappen te verplaatsen en, tegelijkertijd, meet deze kleine bewegingen, " zei Jevgeny Nazaretski, een fysicus en röntgenmicroscopie-instrumentatiespecialist bij NSLS-II. "We moesten expertise uit verschillende gebieden, zoals röntgenmicroscopie en structurele biologie, combineren om dit soort ontwikkeling mogelijk te maken."

Brookhaven's Laboratory Directed Research and Development-programma financierde het twee jaar durende ontwerp- en constructieproces, inclusief alle stappen van conceptueel ontwerp en laboratoriumkarakterisering tot integratie van het systeem in de experimentele omgeving bij de FMX-bundellijn. Yuan Gao, een onderzoeksmedewerker in dit project, heeft de goniometer in de loop van de ontwikkeling grondig getest op zijn stabiliteit en optimale prestaties en heeft scansnelheden tot 100 Hertz en data-acquisitiesnelheden van 750 frames/seconde aangetoond. Een enkel seriële kristallografie-experiment kan honderdduizenden datumframes vereisen.

Om de prestaties van de nieuw ontwikkelde goniometer te demonstreren, het team gebruikte het om de structuren van twee bekende eiwitten te karakteriseren, rundertrypsine en proteïnase K, en vergeleken hun nieuwe reconstructies met de bestaande kennis over deze twee eiwitstructuren.

"We hebben deze twee bekende eiwitten gemeten met behulp van de FastForward-goniometer bij FMX en een workflow voor gegevensverwerking ontwikkeld die de gegevens automatisch analyseerde terwijl we ze verzamelden, " zei Wuxian Shi, een wetenschapper bij de FMX beamline. "Hiermee, we waren in staat om de structuren op te lossen en aan te tonen dat de gegevens structuren met een hoge resolutie en hoge kwaliteit gaven, zelfs bij de hoogste inzamelsnelheden."

Als volgende stap, het team werkt eraan om robotmonsteruitwisseling tijdens de experimenten mogelijk te maken om de doorvoer van de FMX-bundellijn nog verder te vergroten. Dit systeem wordt dan beschikbaar gesteld aan de algemene gebruikersgroepen van de beamline, en een weg openen naar structuurbepaling van kristallen die kleiner zijn dan ooit tevoren.