science >> Wetenschap >  >> Chemie

Lichtgevoelige E. coli functionele biofilms als steigers voor hydroxyapatietmineralisatie

Engineering lichtgevoelige E. coli functionele biofilms als steigers voor HA-mineralisatie. Engineering lichtgevoelige E. coli functionele biofilms als steigers voor HA-mineralisatie. (a) Schematische illustratie van wildtype E. coli-biofilms die extracellulaire CsgA-amyloïde nanovezels omvatten, die belangrijke biofilm-eiwitcomponenten zijn die bijdragen aan een robuuste hechting van biofilms aan vaste oppervlakken. (b) Schematische illustratie van Mfps van de zelfklevende plaques van de Californische mossel M. californianus. Mfp3S-pep (hieronder) is een bio-geïnspireerd adhesief peptide dat het oorspronkelijke Mfp3S-eiwit nabootst dat wordt aangetroffen in de adhesieve plaques van M. californianus. Mfp3S-pep is verrijkt met asparaginezuur (blauw), lysine (groen) en tyrosine (rood) residuen, bekend om hun functionele rol bij het bevorderen van de kiemvorming, groei en adhesie van HA. (c) Schematische weergave van de genetische componenten van de op licht reagerende E. coli-biofilm. Het ontwerp van functionele biofilms werd mogelijk gemaakt door sequenties te fuseren die coderen voor het CsgA-eiwit en Mfp3S-pep, beide gepositioneerd stroomafwaarts van het lichtgevoelige pDawn transcriptionele controle-element. In het pDawn-circuit, de constitutieve expressie van histidinekinase YF1 en zijn verwante responsregulator FixJ wordt strak gereguleerd door de LacIq-promoter, terwijl expressie van de λ-faagrepressor cI wordt gecontroleerd door de FixK2-promoter. Bij blauwlichtverlichting, kinase-activiteit van YF1 en de daaruit voortvloeiende expressie van cI worden beide geremd, die op zijn beurt de λ-promoter pR activeert om de expressie van CsgA-Mfp3S-pep te bevorderen. ( d ) Schematische weergave van lokale afzetting van HA-mineralen op de functionele extracellulaire nanovezels bestaande uit CsgA-Mfp3S-pep-fusie-eiwitten, uitgescheiden door gemanipuleerde lichtgevoelige E. coli, de lichtontvanger-CsgA– Mfp3S-pep-stam. (e) TEM-afbeelding met cellen en extracellulaire matrix met overvloedige amyloïde vezels in de biofilms. Schaalbalk, 500 nm. F, TEM-afbeelding die de gevormde composiet en latachtige kristallen toont die neergeslagen zijn op de oppervlakken van extracellulaire nanovezels na 7 d mineralisatie in 1, 5 × SBF. Het bijbehorende SAED-patroon geeft diffractiebogen weer die zijn toegewezen aan de (002), (211) en (004) vliegtuigen. Schaalbalk, 500 nm. G, EDS-toewijzing ter illustratie van de Ca, O- en P-elementen die intrinsiek zijn toegewezen aan de HA-fase. Schaalbalken, 500 nm. Credit: Natuur Chemische Biologie , doi:https://doi.org/10.1038/s41589-020-00697-z

Levende organismen hebben mechanismen van biomineralisatie ontwikkeld om structureel geordende en milieuvriendelijke composietmaterialen te bouwen. Hoewel onderzoeksteams het biomimetische mineralisatieonderzoek in het laboratorium aanzienlijk hebben verbeterd, het is nog steeds moeilijk om gemineraliseerde composieten te vervaardigen met structurele kenmerken en levende componenten die veel lijken op hun oorspronkelijke tegenhangers. In een nieuw rapport dat nu is gepubliceerd op Natuur Chemische Biologie , Yanyi Wang en een onderzoeksteam in de natuurkunde, geavanceerde materialen, Synthetische biologie, en techniek in China, ontwikkelde composieten met levende patronen en gradiënten geïnspireerd op natuurlijke materialen. Ze koppelden licht-induceerbare bacteriële biofilmvorming aan biomimetische hydroxyapatiet (HA) mineralisatie in dit werk, om te laten zien hoe de locatie en de mate van mineralisatie kunnen worden gecontroleerd. De cellen in de composieten bleven levensvatbaar terwijl ze omgevingssignalen waarnamen en erop reageerden. De composieten vertoonden een 15-voudige toename in Young's modulus (d.w.z. stijfheid, de verhouding tussen spanning en rek) na mineralisatie. Het werk werpt licht op de ontwikkeling van levende composieten met dynamisch reactievermogen en aanpassingsvermogen aan de omgeving.

Biomineralisatie in het lab

Levend organisme kan een verscheidenheid aan hiërarchische organisch-anorganische composietstructuren produceren op basis van biomineralisatie, waar opmerkelijke voorbeelden zijn de radulaire tanden van chitons, visschubben en kaken van rivierkreeften die verschillende biologische functies vervullen. De timing en mate van biomineralisatie moeten nauwkeurig worden gecontroleerd door cellen om nauwkeurige structuren en functies in levende organismen te vormen. Recent onderzoek naar biomimetische mineralisatie had het belang benadrukt van het verkennen van celgecontroleerde benaderingen om levende patronen en gegradeerde composieten te produceren als een veelbelovend maar grotendeels onontgonnen gebied. De disciplines synthetische biologie en materiaalwetenschap hebben een reeks geavanceerde en milieuvriendelijke gencircuits ontketend om een ​​reeks nieuwe cellulaire functies te ontwikkelen. In dit werk, Wang et al. ontwikkeld bio-geïnspireerd, levende composietmaterialen door gebruik te maken van door licht induceerbare biofilms van Escherichia coli in combinatie met biomimetische mineralisatie. Het werk zal deuren openen om gemanipuleerde cellen te integreren om gemineraliseerde materialen te produceren met structurele en levende kenmerken.

Ruimtelijk controleerbare mineralisatie van door licht induceerbare biofilms voor composieten met een levend patroon. (a) Schematische voorstelling van de experimentele opstelling en opeenvolgende stappen voor het produceren van composieten met levende patronen. Het blauwe bladpatroon dat in de illustratie wordt weergegeven, werd geprojecteerd op een petrischaal die de lichtontvanger-CsgA-Mfp3S-pep-stam gesuspendeerd in medium bevatte. Blauw licht veroorzaakt functionele biofilmvorming door de door licht gereguleerde expressie van CsgA-Mfp3S-pep-eiwitten van de lichtontvanger-CsgA-Mfp3S-pep-stam. Het kweekmedium in de petrischaal werd vervolgens vervangen door 1,5 x SBF, gevolgd door incuberen bij 37°C om composieten te vormen. Na het mineralisatieproces, aTc werd toegevoegd om de expressie van een rood fluorescerend eiwit (mCherry) te induceren. (b) Digitaal camerabeeld van de biofilms met patronen gekleurd met CV. Schaalbalk, 1 cm. (c) SEM-afbeeldingen die de oppervlaktemorfologie van de biofilms met patronen tonen. Schaalbalken:2 m (links), 1 µm (rechts). (d) Digitaal camerabeeld van de daaropvolgende gemineraliseerde composiet die het oorspronkelijke patroon behield. Schaalbalk, 1 cm. (e) SEM-afbeeldingen die de oppervlaktemicrostructuren van de gemineraliseerde composiet tonen. Schaalbalken:2 m (links), 1 µm (rechts). (F, g) Confocale laser scanning microscopie analyse van bacteriële levensvatbaarheid in biofilms (f) en composieten (g). Schaalbalken, 5 µm. Merk op dat SYTO 9-kleurstof en PI werden toegepast als etiketteringsmiddelen om levende (groene) en dode (rode) cellen te kleuren, respectievelijk. (h) Geïnduceerde fluorescentie van de levende composiet opgenomen met een ChemiDoc XRS-systeem. Schaalbalk, 1 cm. l, Confocale microscopie toonde mCherry-expressie van de bacteriën in de composiet aan. Schaalbalk, 20 µm. J, Confocale beelden van een levend composiet na het induceren van mCherry-expressie en labeling met calceïne, wat een homogene verdeling van organische componenten en anorganische mineralen in de van een patroon voorziene levende composieten aangaf. Schaalbalken, 20 µm. Credit: Natuur Chemische Biologie , doi:https://doi.org/10.1038/s41589-020-00697-z

Selectie van eiwitmodules voor mineralisatie van hydroxyapatiet (HA) en ontwikkeling van een lichtgevoelige biofilm

Het team selecteerde fusie-eiwitten om mineralisatie te ontwikkelen die E. coli-biofilms bevordert. Op basis van eerdere experimenten, ze selecteerden eiwit Mefp5 – afkomstig van Mytilus edulis, gevolgd door Mfp3S – afkomstig van Mytilus californianus en een andere variant van het Mfp3S-peptide (Mfsp3S-pep) om mineralisatie te initiëren en adhesie te bevorderen. Het team construeerde fusie-eiwitten die een belangrijk eiwitdomein van de E. coli-biofilm bevatten om CsgA-Mfp-fusie-eiwitten te vormen en bevestigde hun mogelijke uitscheiding door gemanipuleerde cellen. Ze selecteerden vervolgens het CsgA-Mfp3S-pep-fusie-eiwit als vertegenwoordiger voor hydroxyapatietmineralisatie en voerden experimenten uit om de functie van het eiwit te verifiëren om hun rol tijdens mineralisatie en kristalvorming te benadrukken. Daarna, Wang et al. construeerde een licht-induceerbare biofilmvormende stam genaamd light ontvanger -CsgA-Mfp3S-pep die strak kan worden geregeld via blauwlichtverlichting.

De lichtgevoelige stam zou functionele biofilmmaterialen kunnen genereren na belichting met licht om de mineralisatie van hydroxyapatiet (HA) te bevorderen. Om dit te valideren, de wetenschappers stelden de lichtgevoelige stam bloot aan blauw licht in een petrischaal en gebruikten histologische kleuring en transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) beeldvorming om de productie van amyloïde vezels in de biofilms te laten zien. Ter vergelijking, ze hebben geen amyloïde vezels waargenomen in monsters die in het donker zijn gekweekt. De gemanipuleerde extracellulaire matrix fungeerde ook als een sjabloon voor HA-mineralisatie in de tijd, die ze bevestigden na 7 dagen incubatie op basis van röntgendiffractie (XRD) en energie-dispersieve röntgenspectroscopie (EDS) technieken.

Dichtheid-controleerbare mineralisatie in lichtintensiteit-gereguleerde gradiënt biofilms gebruikt om levende graded composieten te fabriceren. (a) Schematische illustratie die de generatie van levende gradiëntcomposieten toont door in situ mineralisatie van biofilms met gradiëntbiomassadichtheden. De gradiëntbiofilms werden gevormd door licht met verschillende intensiteiten en nauwkeurige ruimtelijke controle te projecteren op de petrischaal met de lichtontvanger-CsgA-Mfp3S-pep-stam gesuspendeerd in medium. (b) Digitale camera-afbeelding met CV-gekleurde biofilms met gradiënt biomassa dichtheden. Schaalbalk, 1 cm. (c) Digitaal camerabeeld van later gevormde gradiënt levende composieten na HA-mineralisatie. Schaalbalk, 1 cm. (d) De dikte van biofilms en de vervolgens gemineraliseerde composieten gevormd onder verschillende lichtintensiteiten. Resultaten worden weergegeven als gemiddelde  ± s.d. Gegevens zijn representatief voor n= 5 onafhankelijke experimenten. ( e ) Sectionele SEM-microfoto's die de morfologieën van verschillende regio's (A1-A4) in de op lichtintensiteit gesorteerde biofilms tonen. Schaalbalken, 10 µm. Het inzetbeeld (overgenomen uit het A4-gebied) vertegenwoordigt de typische oppervlaktemorfologie van biofilms. Schaalbalk, 1 µm. ( f ) Sectionele SEM-microfoto's die de morfologieën van verschillende regio's (B1-B4) in de levende gradiëntcomposieten tonen zoals sjabloon door lichtintensiteit-gegradeerde biofilmsteigers. Schaalbalken, 10 µm. Het inzetbeeld (overgenomen uit het B4-gebied) vertegenwoordigt de typische oppervlaktemorfologie van de gemineraliseerde gradiëntcomposieten. Schaalbalk, 1 µm. Merk op dat de dekkingspercentages van 100%, 50%, 25% en 12,5% komen overeen met werkelijke lichtintensiteiten van 0,0306 W cm−2, 0,0268 W cm−2, 0,0178 W cm−2 en 0,0140 W cm−2, respectievelijk. Credit: Natuur Chemische Biologie , doi:10.1038/s41589-020-00697-z

Gecontroleerde levende composieten vormen

Gebaseerd op de lichtgevoelige aard van de gemanipuleerde biofilms, Wang et al. gemanipuleerde biofilmvorming in ruimte-tijd om de vorming van composieten te beheersen. Ze bereikten dit door een bladpatroon te verlichten op vloeibare bacterieculturen in petrischalen van polystyreen die het geprojecteerde lichtpatroon getrouw op de bacteriële biofilms recapituleerden. Na 7 dagen mineralisatie, de composiet gegenereerd in de petrischalen behield het oorspronkelijke patroon zoals waargenomen met behulp van scanning elektronenmicroscopie. De lichtgereguleerde benadering controleerde de vorm van de composiet op basis van rasterpatroonprojecties en ruimtelijke resolutie van licht op microschaal - vergelijkbaar met de grootte van de levende bacteriën. Het team verifieerde vervolgens de levensvatbaarheid van live, intacte cellen door de levende composieten te manipuleren om fluorescerende eiwitten tot expressie te brengen, zoals bevestigd met behulp van confocale microscopiebeelden. Daarna, ze gebruikten thermogravimetrische analyse om de anorganische componenten van gemineraliseerde composieten te kwantificeren, waarbij het anorganische materiaal proportioneel toenam met de tijd bij onderdompeling in gesimuleerde lichaamsvloeistof (SBF). Wang et al. vergeleek ook de Young's modulus van de biofilm met behulp van een micro-inspringtechniek om te laten zien hoe mineralisatie de E. coli-biofilms versterkte om de cellen te beschermen.

Dichtheid gecontroleerde gradiënt composieten

Koppeling van gemanipuleerde biofilms met mineralisatie voor robuuste opname en immobilisatie van microsferen op substraten. (a) Schematische weergave van de vangst en immobilisatie van microsferen op een glasplaatje in oplossing. PS-microsferen gesuspendeerd in kweekmedium werden gevangen en geïmmobiliseerd op een substraat door middel van biofilmvorming gevolgd door mineralisatie in 1, 5 x gesimuleerde lichaamsvloeistof (SBF). (b) Fluorescerende afbeeldingen die de twee soorten biofilms (linker en middelste kolommen) en levende composiet-geïmmobiliseerde microsferen (rechterkolom) op de substraten tonen voor (boven) en na (onder) uitdaging met waterstralen bij een constante afvoerdruk van 8 psi. Schaalbalken, 100 µm. (c) Kwantificering van de relatieve mogelijkheden van verschillende biofilms en levende composieten om PS-microsferen op het substraat te lijmen en te immobiliseren. Resultaten worden weergegeven als gemiddelde  ± s.d. Van links naar rechts:P= 0.00003, P= 0.000004. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0,001. Statistieken worden afgeleid met behulp van een tweezijdige t-test. Gegevens zijn representatief voor n= 3 onafhankelijke experimenten. Credit: Natuur Chemische Biologie , doi:https://doi.org/10.1038/s41589-020-00697-z

Tissue engineering-benaderingen hebben de noodzaak benadrukt om nauwkeurig te identificeren tussen harde en zachte weefsels voor succesvolle fysiologische prestaties, daarom kon de lichtintensiteit worden afgestemd om de dichtheid en mechanische eigenschappen van geconstrueerde levende materialen te regelen. Zhang et al. bereikt dit door E. coli-culturen bloot te stellen aan verschillende intensiteiten van verlichting om te onthullen hoe de biofilmdikte afnam met de afnemende intensiteit van blauw licht. Ze lieten verder zien hoe de mineralisatie strak en lokaal werd gestuurd door de gemanipuleerde Mfsp3S-pep-fusie-eiwitten. Daarna bestudeerden ze de lokale mechanische eigenschappen van verlichte gebieden met micro-inspringing om een ​​viervoudige toename van de Young's modulus te observeren om levende composieten te benadrukken die zijn ontworpen met instelbare minerale gradiënten en mechanische eigenschappen voor regeneratieve weefsel-tot-bot-interfaces in toepassingen voor botweefselengineering.

Levende composieten inzetten voor locatiespecifieke schadeherstel

De wetenschappers bestudeerden ook het vermogen van de gemanipuleerde biofilms om te aggregeren voor schadeherstel door polystyreenmicrosferen te lijmen, naast HA-mineralisatie. Als proof-of-concept, ze pasten levende gemineraliseerde composieten toe om scheuren op het oppervlak van een polystyreen petrischaal te vullen en te repareren. Tijdens de experimenten, de door licht geïnduceerde zelfklevende biofilms vingen microsferen op in oplossing om de opzettelijk gecreëerde beschadigde groef te vullen, terwijl nanovezels in biofilms fungeerden als een sjabloon voor hydroxyapatietmineralisatie om door licht geïnduceerde cementering onder blauwe lichtverlichting te consolideren. Met behulp van scanning elektronenmicroscopie, Wang et al. toonde aan hoe bacteriën en de omringende extracellulaire matrix aan elkaar hechtten met microsferen om de hechtende functie van de levende biofilms te illustreren. De HA-gemineraliseerde composieten vormden dichte, betonachtige lagen die de beschadigde groef opvulden om de mineralisatiefunctionaliteit van de levende composieten te benadrukken voor verbeterde duurzaamheid en reparatietoepassingen.

Toepassing van beheersbare levende mineralisatie voor plaatsspecifieke schadeherstel. (a) Schematische weergave van de toepassing van levende gemineraliseerde composieten om scheuren op het oppervlak van een PS-petrischaal te vullen en te repareren. Van links naar rechts:schadegroef op het petrischaalsubstraat, door licht geïnduceerde zelfklevende biofilms vangen microsferen op in oplossing om de schadegroef te vullen, en nanovezels in biofilms fungeren als een sjabloon voor HA-mineralisatie om het cement te consolideren. (b) SEM-afbeelding die de schadegroef toont. Onderstaand, een schematisch diagram dat de afmetingen van de schadevoor illustreert. Schaalbalk, 50 µm. C, SEM-afbeeldingen die de morfologie tonen van de schadegroef gevuld met de biofilm en microsferen. Schaalbalken:50 m (boven), 5 m (onder). (d) SEM-afbeeldingen die de morfologie van de schadegroef na mineralisatie tonen; HA vult de gaten tussen bollen. Schaalbalken:50 m (boven), 5 m (onder). Merk op dat de plaatsspecifieke schadeherstel-experimenten ten minste drie keer werden herhaald met identieke resultaten. Credit: Natuur Chemische Biologie , doi:10.1038/s41589-020-00697-z

Outlook

Op deze manier, Yanyi Wang en collega's produceerden bio-geïnspireerde composieten met levende patronen en composieten van levende kwaliteit met een lichtgereguleerd biofilmplatform. De resulterende composieten vertoonden een reactievermogen van de omgeving vergelijkbaar met hun oorspronkelijke tegenhangers. De cellen in de composieten bleven levensvatbaar en reageerden zelfs na mineralisatie op omgevingsstimuli. Het werk opent een weg naar het creëren van leven, functionele organisch-anorganische composieten met adaptieve en zelfherstellende eigenschappen met toepassingen in de medische biologie, regeneratieve geneeskunde, en bioremediatie.

© 2020 Wetenschap X Netwerk




Meer >

Meer >

Hoofdlijnen

  1. In vijverschuim, wetenschappers vinden antwoorden op een evolutie die het eerst kwam gevallen
  2. De snelheid van verval berekenen
  3. Hoe Agarose Gel te interpreteren
  4. Eenvoudige manieren om de structuren van de Skull
  5. Olifantenstroperij in Afrika neemt af, maar ivoorvangsten nemen toe:studie
  6. Alles wat je nooit wilde weten over bedwantsen, en meer
  7. Hoge prijzen van dierlijke producten onderdeel van een vicieuze cirkel naar uitsterven
  8. Thomas Malthus: Biografie, Populatietheorie & Feiten
  9. Waarom neemt het DNA-gehalte toe tijdens interfase?

Wetenschap