Een team van wetenschappers, waaronder onderzoekers van de National Synchrotron Light Source II (NSLS-II) - een Office of Science User Facility van het Amerikaanse Department of Energy (DOE) in het Brookhaven National Laboratory van DOE - heeft een nieuwe techniek gedemonstreerd voor het afbeelden van eiwitten in 3D met resolutie op nanoschaal. Hun werk, gepubliceerd in de Tijdschrift van de American Chemical Society , stelt onderzoekers in staat om de precieze locatie van eiwitten in individuele cellen te identificeren, het bereiken van de resolutie van het celmembraan en de kleinste subcellulaire organellen.

"In de structurele biologiewereld, wetenschappers gebruiken technieken zoals röntgenkristallografie en cryo-elektronenmicroscopie om de precieze structuur van eiwitten te leren kennen en hun functies af te leiden, maar we leren niet waar ze functioneren in een cel, "zei de corresponderende auteur en NSLS-II-wetenschapper Lisa Miller. "Als je een bepaalde ziekte bestudeert, je moet weten of een eiwit op de verkeerde plaats functioneert of helemaal niet."

De nieuwe techniek die door Miller en haar collega's is ontwikkeld, is qua stijl vergelijkbaar met de traditionele methoden van fluorescentiemicroscopie in de biologie, waarin een molecuul genaamd groen fluorescerend eiwit (GFP) kan worden bevestigd aan andere eiwitten om hun locatie te onthullen. Wanneer GFP wordt blootgesteld aan UV of zichtbaar licht, het fluoresceert een felgroene kleur, het verlichten van een anders "onzichtbaar" eiwit in de cel.

"Met behulp van GFP, we kunnen zien of een eiwit zich in subcellulaire structuren bevindt die honderden nanometers groot zijn, zoals de kern of het cytoplasma, "Miller zei, "maar structuren zoals een celmembraan, die slechts zeven tot tien nanometer groot is, zijn moeilijk te zien met tags met zichtbaar licht zoals GFP. Om structuren ter grootte van 10 nanometer in een cel te zien, je hebt veel baat bij het gebruik van röntgenstraling."

Om deze uitdaging te overwinnen, onderzoekers van NSLS-II werkten samen met wetenschappers van het Massachusetts Institute of Technology (MIT) en de Boston University (BU) die een röntgengevoelige tag ontwikkelden, een lanthanide-bindende tag (LBT). LBT's zijn zeer kleine eiwitten die stevig kunnen binden aan elementen in de lanthanidereeks, zoals erbium en europium.

"In tegenstelling tot GFP, die fluoresceert bij blootstelling aan UV- of zichtbaar licht, lanthaniden fluoresceren in aanwezigheid van röntgenstralen, " zei hoofdauteur Tiffany Victor, een onderzoeksmedewerker bij NSLS-II. "En aangezien lanthaniden van nature niet in de cel voorkomen, als we ze zien met de röntgenmicroscoop, we kennen de locatie van ons interessante eiwit."

De onderzoekers van NSLS-II, MIT, en BU werkten samen om LBT-technologie te combineren met röntgenfluorescentie.

"Hoewel LBT's het afgelopen decennium op grote schaal zijn gebruikt, ze zijn nooit gebruikt voor röntgenfluorescentiestudies, " zei Molenaar.

Naast het verkrijgen van afbeeldingen met een hogere resolutie, Röntgenfluorescentie zorgt tegelijkertijd voor chemische beelden op alle sporenelementen in een cel, zoals kalk, potassium, ijzer, koper, en zink. In andere onderzoeken, Het team van Miller onderzoekt hoe sporenelementen zoals koper verband houden met de dood van neuronen bij ziekten zoals de ziekte van Alzheimer. Het visualiseren van de locatie van deze elementen in relatie tot specifieke eiwitten zal de sleutel zijn tot nieuwe bevindingen.

Naast hun compatibiliteit met röntgenstralen, LBT's zijn ook gunstig vanwege hun relatief kleine formaat, vergeleken met tags voor zichtbaar licht.

"Stel je voor dat je een staart aan je had die zo groot was als je hele lichaam, of groter, Miller zei. "Er zouden veel normale activiteiten zijn die je niet meer zou kunnen doen. Maar als je maar met een klein varkensstaartje rond zou moeten lopen, je zou nog kunnen rennen, springen, en passen door deuropeningen. GFP is als de grote staart:het kan een echte belemmering zijn voor de functie van veel eiwitten. Maar deze kleine lanthanide-bindende tags zijn bijna onzichtbaar."

Om het gebruik van LBT's voor het afbeelden van eiwitten in 3D met resolutie op nanoschaal aan te tonen, de onderzoekers van MIT en BU labelden twee eiwitten in een bacteriële cel:een cytoplasmatisch eiwit en een membraaneiwit. Vervolgens, Het team van Miller bestudeerde het monster bij de Hard X-ray Nanoprobe (HXN)-bundellijn bij NSLS-II en de Bionanoprobe-bundellijn bij de Advanced Photon Source (APS) - een DOE Office of Science User Facility bij DOE's Argonne National Laboratory.

"HXN biedt de toonaangevende röntgenfocusgrootte, wat terugloopt tot ongeveer 12 nanometer. Dit was van cruciaal belang voor het afbeelden van de bacteriële cel in 3D met resolutie op nanoschaal, " zei Yong Chu, lead beamline scientist bij HXN. "We hebben ook een nieuwe manier ontwikkeld om de cellen op een gespecialiseerde monsterhouder te monteren om de efficiëntie van de metingen te optimaliseren."

Door de ongeëvenaarde resolutie van HXN te koppelen aan de mogelijkheden van LBT's, het team was in staat om beide getagde eiwitten in beeld te brengen. Door het celmembraaneiwit te visualiseren, is bewezen dat LBT's met een hoge resolutie kunnen worden gezien, terwijl beeldvorming van het cytoplasmatische eiwit aantoonde dat LBT's ook in de cel konden worden gevisualiseerd.

"Bij hoge concentraties, lanthaniden zijn giftig voor cellen, "Victor zei, "Dus het was belangrijk voor ons om te laten zien dat we cellen konden behandelen met een zeer lage lanthanideconcentratie die niet-toxisch en substantieel genoeg was om voorbij het celmembraan te komen en de eiwitten die we wilden zien in beeld te brengen."

Nutsvoorzieningen, met deze nieuwe techniek succesvol gedemonstreerd, wetenschappers hopen LBT's te kunnen gebruiken om andere eiwitten in de cel in beeld te brengen met een resolutie van 10 nanometer.