Onderzoekers van de Universiteit van Illinois bereikten de hoogste gerapporteerde percentages voor het inbrengen van genen in menselijke cellen met het CRISPR-Cas9-genbewerkingssysteem, een noodzakelijke stap voor het benutten van CRISPR voor klinische gentherapietoepassingen.

Door de uiteinden van het in te voegen DNA chemisch te tweaken, de nieuwe techniek is tot vijf keer efficiënter dan de huidige benaderingen. De onderzoekers zagen verbeteringen op verschillende genetische locaties die werden getest in een menselijke niercellijn, zelfs 65% invoeging zien op een plaats waar de vorige high 15% was.

Onder leiding van professor Huimin Zhao, professor in de chemische en biomoleculaire techniek, de onderzoekers publiceerden hun werk in het tijdschrift Natuur Chemische Biologie .

Onderzoekers hebben ontdekt dat CRISPR een efficiënt hulpmiddel is om uit te schakelen, of "knock-out, " een gen. Echter, in menselijke cellen, het is geen erg efficiënte manier geweest om een ​​gen in te voegen of te 'inslaan'.

"Een goede knock-in-methode is belangrijk voor zowel gentherapietoepassingen als voor fundamenteel biologisch onderzoek om genfunctie te bestuderen, " zei Zhao, die het ontwerpthema voor biosystemen leidt bij het Carl R. Woese Institute for Genomic Biology in Illinois. "Met een knock-in methode, we kunnen een label aan elk gen toevoegen, bestudeer de functie en zie hoe genexpressie wordt beïnvloed door kanker of veranderingen in de chromosoomstructuur. Of voor gentherapietoepassingen, als iemand een ziekte heeft die wordt veroorzaakt door een ontbrekend gen, we willen het kunnen plaatsen."

Op zoek naar een manier om de efficiëntie te verhogen, Zhao's groep keek naar 13 verschillende manieren om het ingevoegde DNA te modificeren. Ze ontdekten dat kleine veranderingen aan het uiteinde van het DNA zowel de snelheid als de efficiëntie van het inbrengen verhoogden.

Vervolgens, de onderzoekers testten het invoegen van eind-gemodificeerde DNA-fragmenten van verschillende groottes op meerdere punten in het genoom, met behulp van CRISPR-Cas9 om specifieke sites voor invoeging nauwkeurig te targeten. Ze ontdekten dat de efficiëntie twee tot vijf keer verbeterde, zelfs bij het inbrengen van grotere DNA-fragmenten - de moeilijkste invoeging om te maken.

"We speculeren dat de efficiëntie zo veel is verbeterd omdat de chemische modificatie tot het einde het DNA stabiliseert dat we invoegen, "Zei Zhao. "Normaal gesproken, wanneer je DNA in de cel probeert over te brengen, het wordt afgebroken door enzymen die het van de uiteinden wegvreten. We denken dat onze chemische toevoeging de uiteinden beschermt. Er komt meer DNA in de kern, en dat DNA stabieler is, dus daarom denk ik dat het een grotere kans heeft om in het chromosoom te worden geïntegreerd."

Zhao's groep gebruikt de methode al om essentiële genen te taggen in genfunctiestudies. Ze gebruikten met opzet kant-en-klare chemicaliën om de DNA-fragmenten te wijzigen, zodat andere onderzoeksteams dezelfde methode konden gebruiken voor hun eigen genetische studies.

"We hebben in het verleden nogal wat knock-in-methoden ontwikkeld, maar we hebben er nooit aan gedacht om alleen chemicaliën te gebruiken om de stabiliteit van het DNA dat we willen invoegen te vergroten, " zei Zhao. "Het is een simpele strategie, maar het werkt."