Het zou onmogelijk zijn om het leven te begrijpen zonder een stevige greep te hebben op de microscopische interacties tussen moleculen die in en rond cellen plaatsvinden. Microscopen zijn en zijn in dit opzicht een onschatbaar hulpmiddel geweest voor onderzoekers, en er bestaan ​​veel verschillende soorten microscopen en microscopietechnieken. Overeenkomstig, deze verschillende technieken dienen verschillende doelen en hebben voor- en nadelen.

In biologie en geneeskunde in het bijzonder, onderzoekers zoeken microscopietechnieken om driedimensionale informatie te verkrijgen over de rangschikking en oriëntatie van individuele moleculen in cellen op nanometerschaal. Een plausibele benadering om dit te bereiken is cryogeen (dat wil zeggen, bij extreem lage temperaturen) elektronentomografie. Echter, deze techniek kan niet worden gebruikt om het inwendige van cellen te observeren en is beperkt tot dunne plakjes die uit de monstercel worden gehaald, wat niet zo nuttig is als het direct kunnen lokaliseren van moleculen in intacte cellen.

Om meer bruikbare metingen te verkrijgen, zichtbaar licht kan worden gebruikt om speciale monsters te verlichten in de zogenaamde fluorescentiemicroscopie. Bij gebruik van deze methode, de doelmoleculen zijn gelabeld met "fluoroforen, ", dit zijn kleine moleculen die energie absorberen van licht van een specifieke kleur (frequentie) en het vervolgens opnieuw uitstralen door te gloeien. Hoewel is gemeld dat deze benadering nuttig is voor het lokaliseren van individuele fluoroforen in het XY-vlak (een plat oppervlak), zinvolle 3D-lokalisatie van biomoleculen vereist meer precisie in de Z-richting, of diepte, dan wat momenteel mogelijk is.

Dat is de reden waarom een ​​team van onderzoekers van Tokyo Tech, waaronder Dr. Satoru Fujiyoshi, Nagoya University en Kyoto University doken diep in cryofluorescentiemicroscopie om inzicht te krijgen in de bronnen van fouten in dergelijke metingen en manieren om ze te corrigeren. De monsters die ze gebruikten waren DNA-moleculen van bekende lengte (10 nanometer) met aan elk uiteinde verschillende fluoroforen.

aanvankelijk, na het verkrijgen van afbeeldingen van beide fluoroforen en het bepalen van de afstand ertussen om te zien of deze overeenkwam met de lengte van de DNA-moleculen, er was een significante fout in hun metingen. Dit werd veroorzaakt door de oriëntatie van de fluorofoor in de 3D-ruimte, die niet altijd perfect was uitgelijnd met het waarnemingsvlak en in plaats daarvan gekanteld of hellend was. Dit staat bekend als het "dipooloriëntatie-effect" en is een ernstige beperkende factor bij fluorescentiemicroscopie. Het effect is gekoppeld aan de slechte meetnauwkeurigheid in de Z-richting en, zoals de onderzoekers hebben aangetoond, gecorrigeerd kan worden.

Hier komt het meten onder cryogene omstandigheden om de hoek kijken. De moleculen worden onmiddellijk op hun plaats bevroren, waardoor de zeer nauwkeurige 3D-metingen mogelijk zijn die het dipooloriëntatie-effect tegengaan. De precisie (reproduceerbaarheid) waarmee de fluoroforen werden gelokaliseerd was ±1 nanometer op het observatievlak en ±11 nanometer in de Z-richting, of diepte, wat ongekend is voor dit type microscopie. Door deze correcties de onderzoekers slaagden erin om de fluoroforen op de DNA-moleculen te lokaliseren met nanometer-nauwkeurigheid (overeenkomst met echte waarde). "Door het dipooloriëntatie-effect te corrigeren, we zijn erin geslaagd om de lokalisatienauwkeurigheid van deze fluoroforen tot op nanometerniveau te verbeteren, " merkt Dr. Fujiyoshi op.

Het onderzoeksteam zal hun werk aan deze aanpak voortzetten met behulp van een paar fluoroforen die speciaal zijn ontworpen voor cryogene omstandigheden, waarmee ze nog betere resultaten verwachten. "Dit type cryo-fluorescentiemicroscopie zal bijdragen aan het onthullen van de mechanismen en processen in cellen op moleculair niveau, " zegt dr. Fujiyoshi.