Het vermogen om grote eiwitkristallen te laten groeien is het grootste knelpunt dat het gebruik van neutroneneiwitkristallografie in structurele biologie beperkt. Eiwitkristallen moeten een volume hebben van minimaal 0,1 mm ³ . Theoretisch is er geen specifieke reden waarom kristallen van deze grootte niet kunnen worden gekweekt. Als ze kunnen zijn, neutroneneiwitkristallografie kan cruciale informatie verschaffen over de locatie van waterstofatomen, details met betrekking tot hydratatie, waterstofbinding en ligandinteracties. Dit soort informatie is direct relevant voor academisch en farmacologisch gedreven onderzoek in de life sciences.

De uitdaging is dus om grote kristalgroei te realiseren in een reproduceerbare, tijd besparen, arbeidsbesparende manier. Het zou ideaal zijn als in de toekomst neutronenkristallografen kunnen, na geschikt voorkarakteriseringswerk, hun oplossingen voor te leggen aan een geautomatiseerd of semi-automatisch platform waarmee op zeer systematische wijze een groot aantal omstandigheden kan worden onderzocht en waarmee gebruikers de groei vanaf hun externe computers kunnen volgen.

Ashley Jordan aan het Institut Laue-Langevin (ILL) in Grenoble, Frankrijk, heeft twee nieuwe kristalgroeimethoden onderzocht:de ontwikkeling van een module die in de toekomst grootschaliger geautomatiseerde benaderingen mogelijk zou maken (taak 1), en een stroomkristallisatiesysteem (taak 2).

Taak 1:Een module voor geautomatiseerde verkenning van grote kristalgroei

Dit SINE2020-project heeft zich gericht op de ontwikkeling van een temperatuurbestuurbare multi-well module waarin kristalgroei kan worden geoptimaliseerd. Het idee van het ontwerpen van deze module was om de aanpak op te schalen, zodat meerdere kristallisatieputten met individuele (programmeerbare) temperatuurregeling kunnen worden gebruikt om een ​​breed scala aan groeiomstandigheden te verkennen. Er werd een prototypemodule gemaakt die bestond uit een op maat gemaakt plaatontwerp met 6 × 4 putjes waar de individuele kristallisatie-experimenten kunnen plaatsvinden. Elke put kan worden aangepast aan verschillende omstandigheden, met elk een onafhankelijke temperatuurregeling. De putten worden verwarmd met Peltier-verwarmingselementen met een temperatuurfeedbacksysteem waarmee elke put kan worden verwarmd en gekoeld over een temperatuurbereik van 4 ° C tot 60 ° C, met een nauwkeurigheid van 0,1 graad. De opstelling is zo ontworpen dat de kristalgroei kan worden gevolgd en fotografisch kan worden vastgelegd.

Ashley Jordan, Ryo Mizuta en John Allibon (die de software hebben ontwikkeld) hebben het prototypesysteem gebouwd en getest. Er zijn kristallisatietesten uitgevoerd met trypsine en rubredoxine.

Post-SINE2020, het idee zou zijn om deze modules "plug and play" te maken, zodat een meer uitgebreide 'robotische' benadering zou kunnen worden gebruikt. Kristallogenese-runs kunnen na voltooiing door de gebruiker worden verwijderd en andere runs kunnen worden geïnstalleerd met behulp van een andere module – de module zou de werkeenheid van een grotere array zijn – waarbij ze allemaal door een camera kunnen worden gevisualiseerd en time-lapse-informatie kunnen worden verstrekt aan een gebruikersportaal.

Taak 2:Stroomkristallisatie

Een andere manier om grote kristalgroei na te streven is het idee van een stroomkristallisatiesysteem. Het idee is om tijdens de groei te allen tijde stabiele batchcondities rond een kristal te handhaven, door een constante toevoer van verse eiwitvoorraad aan de kristallisatieomgeving te verschaffen. Dit zorgt te allen tijde voor optimale oplossingsomstandigheden en helpt ophoping van onzuiverheden op kristaloppervlakken te minimaliseren - dergelijke onzuiverheden kunnen kristalgroei belemmeren.

Er is gekozen voor een Dolomite Mitos P-pomp om het extreem lage debiet (tussen 70-1500 nl min-1) te behouden dat nodig is om het systeem te regelen. Een geschikte kristallisatiekamer die op de pomp kan worden aangesloten, is ontworpen en gemaakt met behulp van een 3D-printer. Deze kamer creëert een afgesloten omgeving en biedt gemakkelijke toegang tot de kristallen zodra ze zijn gegroeid.